第六章发酵过程参数测定

第六章发酵过程参数测定第1页，课件共84页，创作于2023年2月由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）传感器性能要稳定，受气泡影响小。第2页，课件共84页，创作于2023年2月带计算机数据采集与控制的生物反应系统P188第3页，课件共84页，创作于2023年2月原理：化学或物理信号电信号放大记录显示仪控制器（与设定参数比较）发出调节信号控制器动作第4页，课件共84页，创作于2023年2月介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理

pH电极溶氧电极它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极第5页，课件共84页，创作于2023年2月（一）pH测量pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过程控制是一个非常重要的参数。1、pH的定义影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式上的麻烦引进pH=-lg[H+][H+]=0.00001时用pH5表示第6页，课件共84页，创作于2023年2月2、pH测量方法

pH试纸曾经是一种广泛采用的方法优点：方便，易操作缺点：它主观性较强质量差异，不同厂家不同批号的pH试纸测出的pH值会有较大的差别，有时甚至达0.5~1。对于一些要求较高的场合就适用pH试纸pH电极第7页，课件共84页，创作于2023年2月（1）pH电极测量原理pH电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电池，该电池的表达式可写为：参比电极溶液X指示电极该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函数。

E[α]=E0-ln1/=E0-2.303pH式中E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电位差计的E值可测出pH值。第8页，课件共84页，创作于2023年2月甘汞电极（a）232型（b）217型1－导线；2－加液口；3-KCl溶液；4－素烧瓷芯；5－铂丝；6－Hg；7－Hg2Cl2一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘汞不会漏失，小管和大管之间充满KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。参比电极第9页，课件共84页，创作于2023年2月

由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐——氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电池可表示为Hg(L)Hg2Cl2(S)Cl-(L)电极电位产生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：2Cl-+2HgHg2Cl2+2e-其电极电位为εCl/HgCl,Hg=ε+ln1/α

由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活度有关而不受被测溶液的酸碱度影响第10页，课件共84页，创作于2023年2月（2）指示电极对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的电极都可用来测定溶液的pH。

离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构其中敏感性膜部分随组成材料的不同而各有特色。测定pH值的玻璃电极的敏感膜是厚度为10－1～10－3mm的玻璃薄膜，其电阻为50～500mΩ。第11页，课件共84页，创作于2023年2月指示电极的关键是敏感膜H+H+H+H+H+H+KCl溶液待测溶液浓度差引起电位差——浓差电极玻璃敏感膜第12页，课件共84页，创作于2023年2月（3）膜电位膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可看作是一种浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并且其中的一价阳离子（如Na+离子）与水中H+离子发生离子交换反应。SiO-Na++H+SiO-H++Na+

使膜表面形成以SiO-H+为主要成分的水合硅胶层，厚度约为10-4~10-5mm第13页，课件共84页，创作于2023年2月液试水合硅胶层

干玻璃层水合硅胶层内参比溶液α1α1’α2’α2ε1—--△ε--—ε2以α1、α2分别表示试液内与内参比溶液中H+离子活度，α1’、α2’分别表示外侧与内侧硅胶层表面H+离子活度，

由于水合硅胶层表面与内（内参比溶液）、外（试液）溶液中的H+离子从活度大的一方向小的一方迁移，使玻璃膜的外、内侧分别产生相界电位ε1和ε2。经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图。则有：外侧:ε1=K1+内侧：ε2=K2+第14页，课件共84页，创作于2023年2月可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，故K1=K2，水合硅胶层表面一价阳离子点已基本被质子占据，故α1’=α2’，于是玻璃膜内、外侧之间的电位差△ε膜=ε1-ε2=

由于内参比溶液的H+活度α2一定，故玻璃膜电位与待测溶液的H+离子活度（pH值）成线性关系。第15页，课件共84页，创作于2023年2月△ε膜=常数+

在25℃下：△ε膜=常数-0.0591pH（试液）但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差别，即使α1=α2时，△ε膜≠0，这差别所产生的电位叫不对称电位（ε不对称），这样整个玻璃电极（指示电极）的电位应是内参比电位、膜电位与不对称电位之和。第16页，课件共84页，创作于2023年2月ε玻璃=ε0+△ε膜+ε不对称其中，ε0与ε不对称对于特定的电极是恒定的，故玻璃电极的电极电位与试液pH值呈线性关系。（4）玻璃电极的性能存在不对称电势不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对称电势可以用已知pH值的标准缓冲液来校正

第17页，课件共84页，创作于2023年2月零电势或等电势点电极电位为零时的溶液pH值称为零电势pH值，该值取决于内参比溶液的pH值。含有0.025mol/l的KCl和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势点为pH=7，在pH<7和pH>7时，玻璃电极的极性发生改变。第18页，课件共84页，创作于2023年2月玻璃电极的测量范围玻璃电极的实际转换系数并不是在整个pH范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，实际的pH响应曲线如图测量值pH在碱性范围内pH>10k降低，测量值偏高在酸性范围内pH<1k升高，测量值偏低…第19页，课件共84页，创作于2023年2月（5）玻璃电极的使用限制对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容易在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声波清洗电极表面。强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，如氢氟酸溶液会破坏电极脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破坏水合硅胶层第20页，课件共84页，创作于2023年2月（6）复合电极将两支电极都装在一根玻璃管中，这种电极叫复合电极，工业上在线检测大都使用这种电极。它结构紧凑，便于安装。第21页，课件共84页，创作于2023年2月pH复合电极的结构屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。当电极插入被测溶液中后，参比电极隔膜被测体系玻璃敏感膜内参比电极之间达到电导通，组成原电池，其原理与双电极pH计的工作原理完全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。第22页，课件共84页，创作于2023年2月（二）敏化离子选择性电极以离子选择性电极为基础电极，通过化学反应或生化反应使离子选择性电极的响应得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包括有气敏电极和酶电极等。第23页，课件共84页，创作于2023年2月气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，而只允许被测定的气体通过，直到透气膜内外两边该气体的分压相等。进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而使中间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物质的量发生变化，并通过选择性电极电位反映出来，达到间接表征被测气体含量的目的。第24页，课件共84页，创作于2023年2月

能用气敏电极测定气体有CO2、NH3、SO2、NO2、H2S、HCN、HF、Cl2、Br2、I2的蒸气等，其中以氨电极比较成熟，应用较广。

1、NH4＋的测量氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨离子可用氨气敏电极来测定。常用的氨电极为：第25页，课件共84页，创作于2023年2月1－电极管；2－透气膜；3－0.1mol/LNH4Cl溶液；4－pH玻璃电极；5－Ag/AgCl参比电极；6，7－玻璃膜；8－可卸电极头；9－内参比溶液，10－内参比电极在电极管内装有玻璃电极——Ag-AgCl电极，底部装有一微孔透气膜，玻璃电极的敏感膜紧贴于透气膜上，中间有一极薄的液层，当氨通过透气膜渗入内充液薄层，即发生如下反应NH3+H2O=NH4++OH-第26页，课件共84页，创作于2023年2月内充液中NH4+远大于生成的NH4+，故其变化可以忽略不计，而薄层的pH则由于OH-的生成而升高，因此由玻璃电极检出OH-的浓度，即可检出NH3的浓度，电极电位与氨的浓度是对数响应。透气膜一般是0.1mm厚的微孔聚四氟乙烯，内充液为0.1mol/L的NH4Cl溶液。氨电极使用的上限为1mol/L,下限为10-6mol/L。第27页，课件共84页，创作于2023年2月2、CO2的测量（1）CO2电极（测溶液中的CO2）结构与氨电极类似。测量CO2时，气体透过电极膜，CO2和水反应，达到以下平衡：CO2+H2OHCO3-+H+产生的氢离子引起pH的变化，就可以测出溶解CO2的浓度。如果CO2扩散在水或NaHCO3的水溶液中，它们的pH值会依据下列的式子而变化：第28页，课件共84页，创作于2023年2月在纯水中pH=常数＋lg

在NaHCO3溶液中pH=常数-lgpCO2在NaHCO3溶液中测量能方便地确定pH和pCO2之间的对应关系。使用特殊的气体渗透膜，它能够使CO2扩散到NaHCO3溶液中去，溶液中pH变化就是CO2实际分压的测量值

第29页，课件共84页，创作于2023年2月(2)尾气CO2的测量常用的尾气测定仪是不分光红外线二氧化碳测定仪（简称IR），其精度高，可达±0.5%，量程的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培养时常被采用。不分光红外线CO2气体分析原理是：除了单原子气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，CO2的红外吸收峰在2.6~2.9μm和4.1~4.5μm之间有两个吸收峰，根据吸收峰值可以求出CO2的所含浓度。第30页，课件共84页，创作于2023年2月（3）尾气氧的仪器分析采用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气氧的含量。第31页，课件共84页，创作于2023年2月通过RQ值的测定，可以分析微生物可能利用的基质——氧化型的或还原型的，分析微生物生长阶段，分析补料的速率是否合理例如，储炬等发现RQ的变化与菌体生长、营养状况以及产生抗生素密切相关。如20h菌丝开始发生膨大，而此时RQ达到峰值开始下降；40h左右RQ降至谷底开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于RQ具有以上的关联特性，他们尝试在avemectin发酵过程中利用RQ作为补料控制的参考之一。3、排气氧、排气CO2和呼吸熵第32页，课件共84页，创作于2023年2月酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应产生的物质的测定，可以推算出反应物的量。例如脲酶电极，把脲酶固定在NH3气敏电极或CO2气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生如下的分解反应：CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2通过NH3或CO2气敏电极测定NH3或CO2的分压即可达到间接测定尿素的目的。4、酶电极第33页，课件共84页，创作于2023年2月（三）溶氧的测定

对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定。溶氧电极可分为极谱型和原电池型。

极谱型需极化电压及放大器，耗氧少，受气流影响小

原电池型简单便宜，适于中小罐。耗氧较大，受气流和气泡影响大。第34页，课件共84页，创作于2023年2月现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用极谱型的复膜氧电极。复膜氧电极可分为敞口式封闭式第35页，课件共84页，创作于2023年2月敞口式在电极的玻璃管上有一个小孔，使玻璃管与环境相通，这样在蒸汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等，有利于保护电极封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸汽灭菌时玻璃管受压大现在使用的大多数是敞口式电极第36页，课件共84页，创作于2023年2月1、复膜氧电极的工作原理阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、锡、铝等组成。当给电极施加极谱电压（0.6~0.8V负电压）时，溶液中的氧就在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电流为饱和电流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱和电流成正比关系。第37页，课件共84页，创作于2023年2月在阴极表面发生的电极反应：1/2O2+H2O+e-2OH-阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子流向阴极，于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，电流越大。阳极上的反应是：Pb+2ACO-Pb(ACO)2+2e-化学信号转变成电信号第38页，课件共84页，创作于2023年2月2、电极的构造在阴极银（铂）片的前面包一张半透膜，氧可以透过半透膜达到阴极上进行电极反应。该半透膜固定在阴极表面。小孔用于压力补偿。第39页，课件共84页，创作于2023年2月3、溶氧电极的影响因素（1）电极的灵敏度电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：IS=NFA(pm/dm)pO2式中IS——电极电流N——电子数F——法拉第常数A——阴极表面积Pm——氧在复膜中的穿透系数PO2——被测溶液中的氧分压dm——膜的厚度第40页，课件共84页，创作于2023年2月增加灵敏度因素：增加膜穿透系数pm减小膜厚度dm增加阴极表面积A扩散速度因为电极表面的氧浓度与液体主流中的氧浓度存在浓度梯度搅拌速度、通气量和培养液粘度第41页，课件共84页，创作于2023年2月（2）温度的影响电极还会受温度的影响氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相扩散增加，增加了电化学反应速率。由于后者影响比较显著，因此随着温度的上升，电极输出电流呈指数上升。所以电极须有温度补偿功能，才能真正反映出氧溶解度变化的情况。第42页，课件共84页，创作于2023年2月4、电极的标定一般测定中应进行以下二点标定（1）零点标定用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋钮显示零值。

（2）饱和校正（满刻度）进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至100%即为饱和值。第43页，课件共84页，创作于2023年2月5.摄氧率r的测定(1)用溶氧电极测定r要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化。测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表的溶氧浓度：

I饱——在饱和氧浓度C*时的电流值I残——氧浓度为零时电极所具有的电流第44页，课件共84页，创作于2023年2月若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。此时，由于耗氧，CL下降，仪表上电流值也不断下降。R=(-△i/△t)

△t——停止供气后CL下降到最低点时所需时间△i——在△t时间内的电流变化第45页，课件共84页，创作于2023年2月(2)用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少，根据排气中的氧含量，可以算出摄氧率设进口氧含量为21%r=每小时通气量×（0.21-出口氧%）*22.4×1000*V第46页，课件共84页，创作于2023年2月6、氧传递系数kLa的测定设备的KLa可以用亚硫酸钠法来测定，但它是在非发酵过程中测定的，不能完全代表发酵过程中的KLa值。其它测定方法有(1)用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定值表示此时供氧和需氧达到平衡，即r=KLa(C*-CL)式中C*可以查得，CL可以用溶氧电极测得，r也可算出，因此可求得KLa值第47页，课件共84页，创作于2023年2月例：一装料为7L的发酵罐，通气量1l/L.m，操作压力为0.3Kg/cm2，在某发酵时间内发酵液的溶氧浓度为饱和氧浓度的25%，空气进入时的氧含量为21%，废气排出时的氧含量为19.8%（1atm时氧饱和浓度C*=0.2mmol/L）求此时菌的摄氧率r=1*7*60/22.4*103*(0.21-0.198)/7KLa＝r/0.26(0.21.0.198)第48页，课件共84页，创作于2023年2月(2)单用溶氧仪测定用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供氧和需氧达到平衡，溶氧是一条水平线。这是停止通气，保持搅拌，在罐顶通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢复通气。这样可以得到溶氧随时间变化的曲线第49页，课件共84页，创作于2023年2月△CL/△t=KLa(C*-CL)-rCL=-1/KLa(△CL/△t+r)+C*将CL对△CL/△t+r作图，得到一条直线，斜率为-1/KLa因此可求得KLa,延长直线与纵坐标相交点为C*溶解氧浓度随通气变化的情况KLa的求取第50页，课件共84页，创作于2023年2月二参数的离线检测进展（一）利用高效液相（HPLC）分析代谢中间产物通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的放矢的控制发酵过程第51页，课件共84页，创作于2023年2月例：鸟苷生产在鸟苷发酵中，发现发酵到40小时后鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖,使发酵过程pH下降，补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？于是进行以下一些测定与分析第52页，课件共84页，创作于2023年2月什么因素导致pH下降？1、有机酸的积累有机酸积累pH下降补加氨水在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的[NH4+]积累，相应出现产苷速率下降。——代谢不正常第53页，课件共84页，创作于2023年2月测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累第54页，课件共84页，创作于2023年2月2、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和[NH4+]积累。第55页，课件共84页，创作于2023年2月氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在8小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在48小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的12.6倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。第56页，课件共84页，创作于2023年2月3、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（GS）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。第57页，课件共84页，创作于2023年2月丙酮酸积累氨水补加增加[NH4+]积累抑制GS抑制TCA循环丙酮酸积累激活磷酸果糖激酶EMP流量增加恶性循环丙氨酸积累第58页，课件共84页，创作于2023年2月（二）代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的时序分析第59页，课件共84页，创作于2023年2月12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以PFK的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对酶活增加，这表明此时通过EMP途径的糖代谢通量已有了明显的增加。第60页，课件共84页，创作于2023年2月丙酮酸激酶时序分析第61页，课件共84页，创作于2023年2月丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素磷酸戊糖途径（HMP）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6－磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化6－磷酸葡萄糖脱氢生成6－磷酸葡萄糖酸内酯。第62页，课件共84页，创作于2023年2月6－磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期6－磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持EMP和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到40小时后，6－磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在HMP途径通量下降而EMP途径通量增加。第63页，课件共84页，创作于2023年2月三羧酸(TCA)循环的关键酶三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。第64页，课件共84页，创作于2023年2月柠檬酸合成酶时序分析第65页，课件共84页，创作于2023年2月从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量并没有发生明显的增加。即代谢流迁移发生在EMP和HMP之间，主要是由于EMP和HMP途径之间的分配平衡被打破所造成的。EMP途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。第66页，课件共84页，创作于2023年2月丙氨酸脱氢酶的时序分析第67页，课件共84页，创作于2023年2月在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。结果加入EMP途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量第68页，课件共84页，创作于2023年2月（三）与产物合成相关的酶和中间物测定例：螺旋霉素生物合成的代谢研究第69页，课件共84页，创作于2023年2月图3螺旋霉素生物合成代谢网络途径

第70页，课件共84页，创作于2023年2月图1螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图

哪个代谢中间物过多积累第71页，课件共84页，创作于2023年2月在发酵后期有FO-Ⅱ积累，要减少FO-Ⅰ转化为FO-Ⅱ必须降低C3酰化酶的活力，但这与SPⅡ、SPⅢ合成有矛盾在发酵结束时，SP-Ⅰ还有一定的积累，如能最大限度的转化为SP-Ⅱ、SP-Ⅲ，即加强步骤3对发酵效率和发酵效价是有积极意义的。而FO-Ⅱ、NSP-Ⅱ的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤4的通量。但由于这几个步骤的转化都是由C3酰化酶催化反应，这给改变通量带来一定的困难。第72页，课件共84页，创作于2023年2月图2有机酸前体的动态流量分布图第73页，课件共84页，创作于2023年2月在图2中，乙酸和丁酸在从40小时开始积累并在64小时达到最高值，对照图3螺旋霉素生物合成代谢网络途径[9]，我们可以推测在发酵中前期在图3中的步骤1也即大环成环步骤有一定程度的“瓶颈”影响，从而导致乙酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺旋霉素的效价。我们测定了内酯环合成相关的酶活——前体的活化第74页，课件共84页，创作于2023年2月酰基激酶和酰基CoA合成酶活性趋势

测定酶活并建立酶活趋势曲线。分析：两种酶在发酵过程中都有两个活性高峰期,但出现的时间相差很大。酰基激酶的活性高峰期主要集中在发酵中前期酰基CoA合成酶的活性高峰期主要集中在发酵中后期。此外，酰基CoA合成酶的活性远小于酰基激酶的