3.1重组DNA技术的基本工具（学生版）

《第3章基因工程》第1节重组DNA技术的基本工具必会知识考点梳理拓展延伸易错警示必会知识一基因工程的概念和诞生1．基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。2．对基因工程概念的理解基因工程的别名基因剪切拼接技术、重组DNA技术、转基因技术操作环境主要在生物体外操作对象基因(DNA)操作水平DNA分子水平基本程序剪切→拼接→导入→表达结果创造出人类需要的新的生物类型和生物产品原理基因重组特点定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限必会知识二基因工程的基本工具基因工程的操作过程至少需要三种“分子工具”：限制性内切核酸酶(准确切割DNA分子的“分子手术刀”)、DNA连接酶(将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”)、载体(将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”)。1．限制性内切核酸酶——“分子手术刀”：切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)作用特点①切割外源DNA，对自身的DNA不起作用，从而达到保护自身的目的。②专一性：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。(3)作用结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式—黏性末端和平末端。①黏性末端：错位切，在识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开，产生的是黏性末端，如下图。②平末端：平切，沿着识别序列的中心轴线切开，产生的是平末端，如下图。2．DNA连接酶——“分子缝合针”：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，依靠的是DNA连接酶。(1)DNA连接酶的作用：连接两个DNA片段的末端，拼接成新的DNA分子。(2)DNA连接酶的种类和特点种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，也能连接双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低(3)作用实质：DNA连接酶能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”：要将外源基因送入受体细胞，还需要有运输工具，这就是“分子运输车”，又叫载体(或运载体)。(1)载体的作用：一是作为运载工具，与外源基因(即目的基因)的DNA片段结合，将目的基因转移到受体细胞中；二是在受体细胞内对目的基因进行大量的复制。(2)常用的载体：①最常用的载体是质粒。②其他载体：噬菌体、动植物病毒等。(3)需具备的条件①能在受体细胞中稳定保存并复制。②具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，便于筛选含重组DNA分子的细胞。④对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。(4)质粒的结构与特点①质粒的结构：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。②质粒的来源：质粒存在于细菌和酵母菌等生物细胞中，最常用的是大肠杆菌质粒。③质粒的本质：环状DNA分子，其基因属于细胞质基因。④质粒作为载体的原因：质粒DNA分子有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中；携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；质粒上常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选；质粒不影响受体细胞正常的生命活动。必会知识三DNA的粗提取与鉴定1．实验原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。(1)DNA的溶解性①DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精(利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质)。②DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCI溶液中溶解度不同(利用这一特点，选择适当浓度的NaCl溶液就能使DNA充分溶解，从而使杂质沉淀：或者让其他成分溶解而使DNA析出，以达到分离的目的)。(2)DNA的鉴定原理：在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色。2．方法步骤(1)实验材料的选取①原则上凡是含有DNA的生物材料都可以用于提取DNA，但是，不同生物的组织中DNA含量不同。选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。②在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。③取材时要注意安全问题，并注意保护环境，不要将珍稀、濒危的生物作为实验材料。(2)通过研磨释放DNA：称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨(可加入少量石英砂助研)。(3)用预冷的酒精溶液提取DNA①在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液，也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。②在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分：或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。(4)二苯胺鉴定DNA分组对照组实验组步骤2mol/L的NaCl溶液5mL不进行任何处理加丝状物或沉淀物加4mL二苯胺试剂，混匀后，将试管置于沸水中加热5min结果溶液不变蓝色溶液逐渐变为蓝色结论DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色必备技能典例精讲模型秒杀巧思妙解必备技能一基因工程的概念[例1](2022秋·四川成都·高二树德中学校考阶段练习)下列与基因工程有关的说法，正确的是(

)A．基因工程育种不能使不同物种的优良性状集中在同一个体中B．常用的基因运载体有大肠杆菌拟核DNA，动植物病毒等C．质粒是基因工程中重要的工具酶之一D．基因工程利用基因重组的原理，可定向改变生物的性状必备技能二限制性内切核酸酶[例2](2022春·吉林·高二校联考期末)下列关于限制性内切核酸酶的叙述，正确的是(

)A．限制性内切核酸酶主要从真核生物中提取B．限制性内切核酸酶能识别和切割RNAC．限制性内切核酸酶能识别任意的核苷酸序列D．限制性内切核酸酶切割DNA后可以形成黏性末端或平末端必备技能三DNA连接酶[例3](2022春·河北石家庄·高二统考期末)下图表示在适宜条件下，两个核酸片段经过X酶的催化作用形成一个DNA分子片段的过程。下列叙述正确的是(

)A．X酶是DNA聚合酶B．X酶可能是从大肠杆菌中分离得到的C．X酶能催化氢键的形成D．X酶能为磷酸二酯键的形成提供能量必备技能四常用载体—质粒[例4](2022春·河北邢台·高二统考期末)将外源基因导入受体细胞时通常利用质粒作为载体，下列关于质粒的说法，错误的是(

)A．质粒具有自我复制能力，存在于细胞核或拟核之外，化学本质是DNAB．质粒具有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中C．真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的D．被用作载体的质粒，通常含有特殊的标记基因。如四环素基因、氨苄青霉素基因等必备技能五DNA粗提取的原理与操作方法[例5](2022秋·浙江宁波·高三镇海中学校考阶段练习)如图是以鸡血为材料进行“DNA粗提取与鉴定”相关实验步骤。用高浓度(2mol/L)的NaCl溶液可溶解DNA，低浓度使DNA析出。下列有关叙述错误的是(

)必备技能六限制酶切割后DNA分子片段的分析[例6](2022春·湖北·高二统考期末)用限制酶HindⅢ、BamHⅠ及两者的混合物分别切割一个长度为4kb(1kb即1千个碱基对)的线性DNA分子，切割产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图甲所示。据此定位这两种限制酶的切割位点如图乙，下列分析错误的是()A．琼脂糖凝胶的加样孔在甲图各图示的上端B．乙图中b也是BamHⅠ的酶切位点C．乙图中cd的长度为0．3kbD．若将这个线性DNA分子首尾相连，用HindⅢ切割，只能形成一个4kb的片段必备技能七基因工程操作中限制酶的选择[例7](2022·福建泉州·统考模拟预测)像BclⅠ(T↓GATCA)、BglⅡ(A↓GATCT)、MboⅠ(↓GATC)这样，识别序列不同、，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是(

)选项切割质粒切割目的基因结果分析ABclI和BglⅡBclI和BglⅡ形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同BBclI和BglⅡMboI切割后的质粒不可自我环化，切割后的目的基因可以自我环化CMboIBclI和BglⅡ形成的重组质粒可被MboI再次切开，但可能无法被BclI和BglⅡ再次切开DMboIMboI切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化A．A B．B C．C D．D必刷好题基础演练能力提升巅峰突破1．(2022秋·四川内江·高二威远中学校校考阶段练习)下列关于基因工程的叙述中，不正确的是(

)A．基因工程操作中需要限制酶、DNA连接酶等多种酶参与B．基因工程中常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒C．基因工程育种的优点是可以集中亲本的优良性状D．一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列2．(2022春·陕西渭南·高二统考期末)有关下图所示的黏性末端的说法，错误的是(

)A．甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的B．甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子C．DNA连接酶的作用位点是b处D．切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端互补结合形成的核苷酸序列3．(2022春·云南楚雄·高二统考期末)图甲、乙分别表示EcoRI和SmaI限制酶识别序列和切割位点(图中箭头处)，可形成不同的末端。据图分析，下列说法正确的是(

)A．限制酶可作用于DNA的磷酸二酯键和氢键B．识别黏性末端的DNA连接酶也能识别平末端C．限制酶的识别序列都是由6个核苷酸组成的D．图甲的末端“缝合”时有氢键的重新连接4．(2022春·山东泰安·高二统考期末)某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法错误的是(

)a酶切割产物(bp)b酶再次切割产物(bp)1600；1100；300800；300A．在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个B．a酶与b酶切出的黏性末端可相互连接C．a酶与b酶切断的化学键均为磷酸二酯键D．a酶与b酶识别切割的序列不同体现了酶的专一性5．(2022春·吉林·高二校联考期末)下列关于DNA连接酶的说法，正确的是(

)A．都能连接黏性末端和平末端B．作用于DNA的氢键C．DNA连接酶和DNA聚合酶作用的部位相同D．都是从原核生物中分离出来的6．(2022春·安徽芜湖·高二校考期末)基因工程需要多种酶的参与。下列有关叙述正确的是(

)A．限制酶主要存在于原核细胞中，可识别DNA或RNA上的碱基序列B．DNA连接酶不能识别DNA上碱基序列，但可识别黏性末端或平末端C．解旋酶可破坏磷酸二酯键和氢键，用于DNA复制过程中解开DNA双螺旋D．成熟mRNA经逆转录酶催化形成的DNA分子能直接转录翻译合成蛋白质7．(2022·浙江·校联考模拟预测)下列关于DNA的粗提取和鉴定活动中的叙述，正确的是(

)A．用香蕉果肉放入研钵中，倒入95%的酒精进行充分研磨B．在漏斗中垫上滤纸，将研磨液过滤入离心管中C．经离心，取上清液倒入冷酒精的小烧杯中D．在含有絮状物的试管中加入亚甲基蓝，进行水浴锅加热显蓝色8．(2022春·山东济宁·高二统考期中)DNA琼脂糖凝胶电泳是指利用在溶液中带负电荷的DNA分子在电场中向正极移动的原理，分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的生物化学技术。下列说法错误的是(

)A．DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢B．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA片段的检测C．拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再用70％的冷乙醇沉淀抽提DNA片段，从而提高回收率D．新冠病毒核酸检测出现假阳性的原因可能是阳性对照中模板核酸与样品交叉污染9．(2022秋·河北邯郸·高三邯郸一中校考阶段练习)甜柿鲜果肉中含有可溶性糖、微量元素、维生素和β一胡萝卜素等多种成分，营养价值高，深受消费者的喜爱。甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因(PDC)密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员进行了下列实验。回答下列问题。(1)启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的位点，同时启动子区域存在着许多调控蛋白的结合位点，RNA聚合酶和调控蛋白共同影响了基因的______水平。(2)PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在___________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物进行__________扩增，在扩增过程中使用的酶称为____，在该酶的作用下可以将4种脱氧核苷酸加到引物____的一端。(3)AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，据此可利用与AD蛋白形成的融合蛋白来筛选待测蛋白。利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含__________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H；将从甜柿中提取的RNA逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点__________(填序号1～5)作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。(4)重组酵母Y1H与Y187能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有__________的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白。10．(2022春·江苏连云港·高二统考期中)科研人员通过观察老年(65岁～79岁)14例、高龄(80岁～89岁)16例及长寿老人(≥90岁)12例，肝、脾组织基因组DNA含量的变化及差异，探讨衰老进程中DNA含量变化的规律，并为今后的衰老相关研究提供实验数据。实验的主要操作步骤如下：一、称取组织100mg放入80℃冰箱；二、将组织放入1.5ml离心管，同时加入样品裂解液，并用微量电动匀浆器充分匀浆；三、加入蛋白酶，56℃消化48h，90℃高温蛋白质变性1h；四、加入______酶和缓冲液，37℃水浴锅中放置1h，以去除样品中的RNA；五、加入等体积的冷乙醇，离心取_