食用菌育种学全套教学课件

食用菌育种学

BreedingforMushroom全套可编辑PPT课件绪论第1章食用菌的生活史第2章遗传与突变(1)第2章遗传与突变(2)第3章菌种分离和鉴定第4章诱变育种第5章代谢控制育种第6章杂交育种第7章分子育种第8章菌种复壮与保藏2小麦育种专家李振声

获2006年度国家最高科技奖袁隆平--水稻育种专家，获2000年度国家最高科技奖34主要教学参考资料《微生物遗传育种学》，廖宇静编，气象出版社，2010《工业微生物遗传育种学原理与应用》，金志华编著，化学工业出版社，2006《工业微生物育种学》，诸葛健主编，化学工业出版社，2006《新编遗传学教程》，李惟基主编，中国农业大学出版社，2002《微生物药物学》，陈代杰编著，华东理工大学出版社，1999《微生物分子育种原理与技术》，汪天虹主编，化学工业出版社，2005《现代遗传学》，赵寿元、乔守怡编，高等教育出版社，2003《现代微生物遗传学》，陈三凤、刘德虎编，化学工业出版社，20035本课程内容及安排（24学时）绪论（2学时）真菌的生活史（2学时）遗传与突变（3学时）食用菌菌种的分离（2学时）诱变育种（2学时）代谢控制育种（2学时）杂交育种（3学时）原生质体育种（2学时）分子育种（4学时）菌种复壮与保藏（2学时）绪论

1.微生物遗传育种学的发生史1.1微生物遗传育种学的发生和发展1.2微生物遗传育种学的地位与作用2.微生物遗传育种学的研究意义3.微生物的遗传物质育种（Breeding）是指通过系统选择、诱变、杂交及体外基因重组等技术来培育具有人们所需特定遗传性质的生物的过程。育种学即育种的方法及原理。遗传学是研究遗传和变异规律的一门学科，是育种的理论基础，是一门应用学科。食用菌育种学是研究食用菌现行品种改良和培育食用菌新品种的学科，是改良食用菌群体遗传结构，使之符合不断发展的食用菌生产需要的一门学科；是研究食用菌品种改良、新品种培育的理论、方法和技术的一门学科。遗传学与育种学具有十分密切的关系，遗传学是通过育种实践形成和发展起来的理论学科，遗传学理论又反过来指导和促进了育种学的发展。9第一节微生物遗传育种学的发展史一、微生物遗传育种学的奠基阶段二、微生物遗传育种学的形成阶段三、微生物遗传育种学的发展阶段10一、微生物遗传育种学的奠基阶段巴斯德曾经观察到炭疽杆菌在高温中培养后毒性大减，而抗原性不变。这一变异现象被成功的应用到炭疽杆菌的疫苗制造上去。1907年第一次对微生物的变异进行专门研究的报告，马西尼的题为《可突变的大肠杆菌》的论文记述了在非乳糖发酵菌株中发现发酵乳糖的变异株一、微生物遗传育种学的奠基阶段12二、微生物遗传育种学的形成阶段塔特姆比德尔与塔特姆利用X射线诱变脉孢菌，发现营养缺陷型，并提出了“一个基因一种酶”的假设。1958年获诺贝尔医学和生理学奖。乔治·比德尔20世纪40年代顺序四分子分析用于着丝粒作图目的基因与着丝粒之间发生重组1、着丝粒为M1分离2、目的基因的分离

M1分离：目的基因与着丝粒之间未发生重组，产生非重组型子囊M2分离：目的基因与着丝粒之间发生重组，产生重组型子囊lysC交换型子囊与非交换型子囊的形成非交换型子囊M1交换型子囊M2

目的基因在M1分离，产生非重组型子囊目的基因在M2分离，产生重组型子囊20世纪40年代20世纪40年代关于细菌耐药性问题；LuriaSEDelbruckM利用著名的波动实验证实了细菌的抗性是基因突变的结果。真菌和放线菌重组现象的发现，使得生物学家认识到微生物、动植物在遗传规律上的一致性。利用基因重组的原理开展杂交育种。这个时期，微生物遗传育种学成为一门独立而完善的学科。另外，转化因子化学本质的阐明；噬菌体作为媒介，转导的发现；原生质体的制备（Weibull）和再生(Mequiller)。20世纪50年代21代表成果：揭示基因的结构和化学本质；阐明突变的分子机制和修复机制；诠释了重组产生的机制，证明了四大重组假说（同源重组、位点特异性重组、转座重组和异常重组）的正确性；揭示质粒的本质与作用；通过基因定位的研究构建了遗传连锁图；基因工程技术的诞生，为基因工程的应用奠定基础。二、微生物遗传育种学的发展阶段代表成果：揭示基因的结构和化学本质；阐明突变的分子机制和修复机制；诠释了重组产生的机制，证明了四大重组假说（转化、转染、转导和接合）的正确性；揭示质粒的本质与作用；通过基因定位的研究构建了遗传连锁图；基因工程技术的诞生，为基因工程的应用奠定基础。231962年，阿贝尔和杜斯索西发现DNA的限制和修饰作用；1964年，莫诺德、钱根和雅各布提出了蛋白变构理论，确定了基因与蛋白质之间的关系，破译了全部有意密码子；1965年，发表了酵母丙氨酸tRNA的完整序列，发现了终止密码子UAG和UAA。发现线粒体具有环状DNA；1970年，发现了RNA反转录酶和限制性内切核酸酶I。二、微生物遗传育种学的形成阶段241972年，创建了DNA体会重组技术；1973年，在体外构建了具有功能的细菌质粒；1975年，建立了DNA体外重组技术、菌落原位杂交技术、2-D电泳技术、单克隆抗体的制备技术；1977年，发现了基因中的内含子和外显子，提出了“断裂基因”的概念。建立了DNA的化学测序法。1978年，首次将真核基因在细菌中表达；1985年，建立了PCR技术。1986年发现了RNA编辑现象。二、微生物遗传育种学的形成阶段251983年大肠杆菌基因组项目启动；上世纪90年代，微生物基因组时代的到来。完成詹氏甲烷球菌、铜绿假单胞菌、裂殖酵母、烟曲霉、酿酒酵母等微生物的测序工作……2006年，启动人类元基因组计划。三、微生物遗传育种学的发展阶段四、微生物遗传育种学研究内容和意义利用微生物遗传学理论和知识进行，对野生型微生物的基因和基因组进行有目的的改良，，选育出具有工业、农业、医学、环境用途的微生物菌种。主要的育种方法包括：自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体育种、代谢控制育种，以及分子育种。27常用的遗传育种技术：自然选育诱变育种杂交育种代谢控制育种分子育种28第四节微生物遗传育种学及其研究进展育种的基础：遗传变异利用什么工具去“触发”变异？诱变杂交分子手段291、自然选育1881年德国RobertKoch提出纯种培养理论，发明固体培养基（重大突破）发明纯种培养法之后——自然选育——自发突变——纯种分离例：卡介苗局限性：自发突变频率低，难以大幅度提高菌种生产水平302、诱变育种20世纪40—50年代人工诱发基因突变Beadle&Tatum用X射线、UV诱变红色面包霉，获得代谢障碍突变株313、杂交育种20世纪50年代后以基因重组为基础把不同菌株的优良性状集中于重组体中2002年出现的基因组改组育种为其特例324、代谢控制育种20世纪50—70年代理性（筛选手段）以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地实现有用产物选择性大量生成和积累336分子育种 20世纪70年代包括基因工程、分子定向进化等四、微生物的遗传物质染色体的组成与结构DNA的一级、二级和三级结构

细胞核中能被碱性染料强烈着色的物质，染色质是真核细胞的遗传物质在分裂间期存在的形式，而染色体是细胞在有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质聚缩而成的棒状结构。两者是细胞周期不同阶段两种可以相互转变的结构。

一般来说，只有在细胞有丝分裂过程中，才能在光学显微镜下观察到染色体。整个细胞周期都能观察到染色体？非分裂期的细胞核经低渗处理、溶胀破裂后释放出染色质，在电子显微镜下呈纤维串珠状的长丝。染色质和染色体：20世纪70年代真核细胞染色体的组成与结构呈酸性，种类和含量不稳定；作用还不完全清楚，可能与染色质结构调节有关，在DNA遗传信息的表达中有重要作用少量的RNA，不到DNA的10%

DNA：

蛋白质：约为DNA的两倍约占30%，每条染色体一个双链DNA分子；是遗传信息的载体，也就是所谓的遗传物质组蛋白：呈碱性，结构稳定；与DNA结合形成核小体、维持染色质结构，与DNA含量呈一定的比例非组蛋白：真核细胞染色体的组成与结构组蛋白的特点：富含两种碱性氨基酸（赖氨酸和精氨酸）根据凝胶电泳性质可将组蛋白分为五种小类型:H1、H2A、H2B、H3、H4在细胞周期特定时间可发生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP核糖基化等。H3、H4修饰作用较普遍，H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。所有这些修饰作用都有一个共同的特点，即降低组蛋白所携带的正电荷。这些组蛋白修饰的意义：一是改变染色体的结构，直接影响转录活性；二是核小体表面发生改变，使其他调控蛋白易于和染色质相互接触，从而间接影响转录活性。组蛋白修饰的种类及其生物学意义C值反常现象（C值矛盾）（C-valueparadox）单顺反子重复序列断裂基因真核生物基因组的特点：C值反常现象（C-valueparadox）

在真核生物中，物种进化的复杂程度与DNA含量C值并不完全一致，称之为C值矛盾(Cvalueparadox)。通常是指一种生物单倍体基因组DNA的总量。在真核生物中，C值一般是随生物进化而增加的，高等生物的C值一般大于低等生物。C值反常现象：一些植物和两栖类动物，它们的DNA含量高达1010－1011bp，而人类DNA含量仅为109bp，显然这是无法解释的。在结构、功能很相似的同一类生物中，甚至在亲缘关系十分接近的物种之间，其C值可以相差数10倍乃至上百倍。如两栖类动物中，C值小的低至109bp以下，C值大的高达1011bp。C值反常现象：单顺反子是真核基因的转录形式.一个启动子后仅具有一个编码序列.多顺反子出现于原核生物,即若干个基因由一个启动子控制,转录在一条mRNA上.在真核细胞DNA中发现某些核苷酸序列大量重复出现，这些核苷酸序列叫重复序列，但在原核细胞基因组中几乎不存在。核苷酸序列的重复次数越高，DNA复性速度就越快。单顺反子&多顺反子；重复序列提问：真核生物中，什么叫单拷贝序列？中拷贝序列？高拷贝序列？结构基因？rRNA，tRNA，组蛋白基因？卫星DNA？请对号入座！思考…….高拷贝序列的生物学意义？思考……基因组重复序列可以同时表达出大量的基因产物以完成生物学功能。另外，大量的重复序列存在，即使其中的极少部分被破坏，也不会影响有机体的正常功能。断裂基因真核生物结构基因，由若干个编码序列和非编码序列互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码序列再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（splitgene）。外显子：将DNA序列中被转录成为mRNA的片段称为外显子（exon或extron）。

内含子：而在成熟mRNA上未反应出的DNA区段称为内含子（intron）1977年，Broker和Sharp等人发现了断裂基因。现在已经知道绝大多数真核生物的基因都是断裂基因。断裂基因是通过mRNA与DNA杂交试验而发现的。一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，然后将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟的RNA分子，这一过程称为RNA剪接（RNAsplicing）。重叠基因

重叠基因是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。重叠方式：大基因之内包含小基因；前后两个基因首尾重叠；3个基因之间三重重叠；反向重叠；重叠操纵子核小体20世纪70年代组蛋白修饰的种类及其生物学意义核小体真核生物转录后加工除了mRNA外，tRNA和rRNA也要经过后加工的过程；真核生物有4种rRNA，即：5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA和5SrRNA。其中前三者的基因组成一个转录单位，产生47S的前体，并很快转变成45S前体。45S前体上有许多甲基化的位点，在转录过程中或转录后被甲基化。甲基基团主要是加在核糖上。甲基化是45S前体最终成为成熟rRNA区域的标志。真核生物的转录后加工5’帽子结构：成熟真核生物的mRNA并没有游离的5’端，而是一种被称为帽子的结构。真核生物的帽子结构可归纳为三种：m7GpppX为帽子0m7GpppXm为帽子1m7GpppXmYm为帽子25’帽子结构不同真核生物的mRNA可有不同的帽子结构，同一种真核生物的mRNA也常有不同的帽子结构。帽子结构的作用：

1.为核糖体识别RNA提供信号；

2.增加mRNA的稳定性；

3.为mRNA向胞质的运输提供信号；

4与某些RNA病毒的正链RNA的合成有关。多数真核生物（酵母除外）的mRNA3’末端具有长约200bp的poly（A）尾巴。poly（A）尾巴不是由模板DNA所编码，而是在转录后由RNA末端腺苷酸转移酶催化下，以ATP为前体，添加到mRNA的3’末端形成的。3’尾巴结构有些mRNA的3’末端没有poly（A）尾巴，如组蛋白的mRNA，其3’末端的正确形成依赖于RNA本身形成的茎环结构，即转录终止于此处。对茎环结构进行突变，只要是维持其二级结构，就不影响转录的终止。说明二级结构所提供的信息比序列本身更重要。真核细胞mRNA前体加尾反应模式图

mRNA的基因在低等真核生物中只有少数含有内含子，为不连续基因。随着进化程度的增高，不连续基因的数目不断增加。细胞核中有一类RNA，十分不稳定，平均长度比mRNA要长，序列的复杂程度非常高，称为核内不均一RNA（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA

）。核基因mRNA的剪接hnRNA以与蛋白质结合的状态存在，形成hnRNP（核糖核蛋白颗粒）。体外研究表明，hnRNP的形状为一个球体和一个与之相连的纤维状结构。在RNA转录生成以后，在核内完成加帽和加尾的同时，内含子的去除即剪切过程也在进行。然后RNA转运到胞浆。核基因mRNA的剪接左（5’）剪接点称为供体位点，右（3’）剪接点称为受体位点。点突变研究证明，剪接位点GT或AG的突变均可以阻止剪接的出现。几乎所有的真核细胞核基因的内含子均遵循GU－AG规则，这也暗示这类内含子存在着共同的剪接机制。但线粒体、叶绿体和酵母tRNA的内含子不遵循这一规则。核基因mRNA的剪接核RNA的剪接点及周围并没有自身的互补序列，5’剪接点总是能正确地与3’剪接点相连。剪接位点具有通用性，而内含子的其他序列（包括二级结构）不提供特定的信息，对剪接不产生影响。剪接装置没有组织特异性，RNA只要含有正确的剪接点，在任何细胞中都可以正确地剪接。核基因mRNA的剪接第一章食用菌的生活史72真菌营养体常见形态食用菌隶属于48个科，144个属

约5%属子囊菌亚门

约95%属担子菌亚门返回本节子

囊

菌麦角菌目、麦角菌科—冬虫夏草盘菌目马鞍菌科马鞍菌属—马鞍菌鹿花菌属—鹿花菌羊肚菌科、羊肚菌属—羊肚菌块菌目、块菌科、块菌属—块菌鹿花菌80真菌的生活史是指从一种孢子开始，经过萌发、生长和发育，最后又产生同一种孢子的个体发育过程。相当于高等植物从种子萌芽、生长发育到开花结实，又形成种子的过程。真菌典型生活史是从有性孢子萌发开始长成菌丝体，然后继续生长发育到一定阶段，就从营养阶段过渡到繁殖阶段；先进行无性繁殖，产生无性孢子，无性繁殖在适宜条件下可重复产生，直到最后进行有性繁殖，产生有性孢子为止。什么是真菌生活史？食用菌的生活史，除了由担孢子（或子囊孢子）生成担孢子（或子囊孢子）的有性繁殖外，另外一些通过无性孢子进行小循环。如银耳的单核菌丝或双核菌丝均可以产生酵母菌状的芽孢子，芽孢子可以在一定条件下又能萌发成单核菌丝或双核菌丝。草菇、香菇的菌丝细胞，有的细胞会增厚，形成休眠孢子—厚垣孢子，厚垣孢子在条件适宜时又萌发为菌丝体。食用菌的无性繁殖食用菌的无性繁殖有田郁夫

光帽鳞伞（5个无性小循环）：单核菌丝不经质配直接形成单核性子实体，子实体又能形成2~4个单核性担孢子，萌发成菌丝；单核菌丝直接断裂成无性的分生孢子，分生孢子萌发又成单核菌丝；双核菌丝断裂成分生孢子，萌发后成双核菌丝；双核菌丝“退化”成单核菌丝，单核菌丝质配成双核菌丝；双核菌丝脱核形成单核分生孢子，发芽为单核菌丝，接合又形成双核菌丝。人们把刚从有性孢子萌发的菌丝体称为单核菌丝体或者出生菌丝体。这种菌丝开始含多个核，后来细胞产生隔膜，使每个细胞各具有一个细胞核。单核菌丝体发育到一定阶段，两个单核菌丝的细胞质融合在一起（质配），成双核细胞，具有双核细胞的菌丝体称为双核菌丝体或次生菌丝体。由于这种双核菌丝的细胞核来自不同的细胞，因此又名为异核体。食用菌的有性繁殖双核菌丝体的菌丝比单核菌丝体的菌丝粗，生长速度也快。此外，双核菌丝体还具有锁状联合结构，大多数食用菌就是通过锁状联合不断分裂细胞而生长的。双核菌丝体在适宜的温度、营养、水分、光照等条件下，能相互扭结结成团，发育成原基。原基是子实体的“胚胎”，进一步发育成子实体。食用菌的有性繁殖子实体虽然已经有组织分化（分为菌盖、菌柄、菌髓、子实层等），但它们都是由双核菌丝组成的，只是处在子实层中的部分细胞，在子实体发育成熟时，二核会合并（核配）成一个核，这样，两个单倍体的核就融合成一个双倍体的合子（2n）。随后，合子通过一次减数分裂及1~2次有丝分裂，染色体减半，最终形成4个担孢子或者8个子囊孢子，从而又开始了它新一代的生活。食用菌的有性繁殖担孢子的形成次生菌丝顶胞核配担子（2n)减数分裂担孢子（n)返回本节返回本节减数分裂核配质配质配同宗结合异宗结合担孢子有性繁殖不同种食用菌在两条单核菌丝质配成双核菌丝时，出现两种不同类型：同宗接合和异宗接合。同宗接合：单核菌丝属“雌雄同株”。即质配发生在由同一个孢子萌发的单核菌丝间，这种现象称为同宗接合。属于同宗结合的约占整个食用菌总数的10%。如双孢菇、草菇、蜜环菌等。异宗接合：单核菌丝属“雌雄异株”。这类食用菌的性别出现在不同孢子或单核菌丝上，只有异性的单核菌丝才能质配成双核菌丝，而同性间永不亲和、结实（指产生有性孢子）。这种现象称为自交不育或异宗接合。如香菇、糙皮侧耳、羊肚菌、木耳、毛木耳和大肥菇等。异性单核菌丝间的接合，是由性基因决定的。在异宗接合担子菌中约有37%的食用菌，其性别只有一对性基因（“Aa”）决定，因此它们的担孢子不是A型，便是a型，称为二级性。另有63%的异宗接合菌，其性别是由两对独立分离的遗传因子（“Aa”“Bb”）决定，其担孢子的性基因分别为“AB”、“Ab”、“aB”、“ab”四型，即4个担孢子分别属于4种基因型，称为四级性。异宗结合的菇类，只有两条性别不同的初生菌丝才能结合配对，又分为二极性和四极性异宗结合两种类型。二极性异宗结合的菇类，其性别由一对遗传因子Aa所决定，只有含A因子的单核菌丝才能和含a因子的单核菌丝结合配对，属于这种类型的有滑菇、木耳，光帽鳞伞以及鬼伞属的一些种，约占食用菌总数的33％。异宗接合的二级性四极性异宗结合的菇类，其性别由两对独立分离的遗传因子Aa、Bb所决定，只有所含的AB两个因子都不相同的两条单核菌丝才能结合，含AB因子的单核菌丝只能和含ab因子的单核菌丝结合配对，含Ab因子的单核菌丝只能和含aB因子的单核菌丝结合配对，属于这些类型的有香菇、毛木耳、平菇、银耳等，约占食用菌总数的57％。异宗结合的菇类，其单孢菌株经配对后，才能产生子实体。异宗接合的四级性总结：如果让各担孢子萌发的单核菌丝自由配对，二级性的能育率为50%，四级性的能育率为25%。第二章遗传与突变第一节突变及突变机制第二节诱变及其诱变剂本章内容：第一节突变及其机制突变是指DNA特定部位上核苷酸序列的改变。基因突变包括遗传物质的改变过程和突变体的形成。从广义上讲，除了转化、转导、接合等遗传物质的传递和重组引起生物变异外，任何可遗传的突变都属突变范围。基因突变形成新的基因型在一定环境条件下表现出来的个体性状称为表型，突变结构产生新表型的个体，称为突变体或突变型。突变是生物遗传性状改变的依据，能在生活周期的任何阶段发生。突变与变异的区别饰变：指生物体本身由于非遗传因素引起的表型改变，变化发生在转录、翻译水平，特点是几乎整个群体中的每个个体都发生同样的变化，性状变化幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。举例：Serratiamarcescens（粘质沙雷氏菌）的红色素在25℃和37℃的变化。突变包括：自发突变和诱发突变（诱变）引起自发突变的原因：1.微生物生活的环境中存在着一些低剂量的物理、化学诱变因素;2.微生物内在因素造成的，如生长发育过程中，DNA在复制过程中出现碱基配对错误或修复过程中发生错误造成的3.微生物自身代谢过程中产生一些具有诱变作用的物质，如过氧化氢、硫氰化合物、咖啡碱、二硫化二丙烯等，使微生物在培养和存放过程中受到诱变作用而产生突变。诱发突变在效应上和自发突变没什么差别，只是人工诱发突变速度快、时间短、突变频率高。突变的分子机制突变的分子机制是DNA分子中碱基序列或碱基对数目的改变，或染色体发生变化。突变基因突变染色体畸变染色体组变基因突变DNA的正常结构受到损伤，碱基对发生变化，通常指基因内部分子结构或基因之间的分子结构发生改变，导致点突变。主要包括碱基置换、移码突变和移位突变等。镰刀型细胞贫血症碱基置换ATTA转换ATGC颠换移码突变DNA分子中的每个碱基是三联密码中的一个成员，遗传信息就体现在这些密码中，当复制或其他诱导因素作用时，碱基序列中的一个或几个碱基发生增加或减少的现象叫移码突变。它使遗传密码发生了位置上的移动，从而造成随后翻译和转录的错误。移码突变分为缺失突变和插入突变。易位突变指DNA链上一个密码子中的某个碱基和邻近密码子中的一个碱基对换，造成二个密码子编写的氨基酸都发生改变，从而引起突变。染色体畸变染色体畸变是染色体结构的变化，和其他突变一样可以引起遗传信息的改变，具有遗传效应。染色体结构改变多是染色体或染色单体遭到巨大损失，使它们断裂。断裂点是随机的也可能是多个。根据断裂的数目、位置、断裂连接方式等可以造成各种不同的突变，包括染色体的缺失、重复、倒位、易位等缺失和重复缺失和重复主要在DNA复制和修复系统进行修饰过程中产生错误造成的。当DNA进行复制时，发生染色体断裂，前面链上的多聚酶掉落下来加到后面尚未复制的DNA上而加以复制，结果前面的链缺失了一个或几个基因的DNA节段，后面的链，由于多加了一段DNA，相同部分出现两次，结果造成突变。缺失损伤是不可逆的，对生物体而言也是有害的，会造成遗传平衡失调。重复突变，从微生物育种角度而言，可能获得具有人们需要的优良性状的新个体，如大幅度提高产量。缺失和重复倒位是指染色体部分节段的位置顺序颠倒而形成的一段不正常的染色体。倒位分臂内倒位和臂间倒位。前者染色体外形不会改变，后者形状会发生改变，但两者表型基本一致。倒位易位指同源染色体之间部分连接而交换。一种情况是两条同源染色体相互间进行部分交换，这种染色体交换节段长短有时可能不等，当长短不同时，会影响到染色体的外形；另一种是一条染色体的部分节段连接到另一非同源染色体上，也称单向易位。易位一般生物含有各种形态、大小、遗传功能不同的染色体各一条，称为染色体组，具有这样一套染色体组的生物叫单倍体生物，有两套染色体组的生物叫二倍体生物，有两套以上染色体组的生物叫多倍体生物，多倍体一般是由变异或异常形成的。（整倍体）染色体组变染色体组变指染色体数目的变化。它可分为整倍体和非整倍体，前者分为单倍体、三倍体、同源多倍体和异源多倍体等。后者有超二倍体和亚二倍体。有的生物由于突变或杂交重组使细胞内的染色体数目比正常二倍体多出或少了一至几条，称为非整倍体，如超二倍体（2n+1）和亚二倍体（2n－1）等。染色体组变整倍体和非整倍体的染色体数目变化一般都在细胞减数分裂和有丝分裂过程中由于环境因素异常的影响，如接触诱变剂、生长条件、代谢条件等物理、化学、生物等因素，使纺锤丝结构受到抑制或破坏，使染色体数目发生各种变化。染色体组变第二节诱变及其诱变剂诱变是诱变剂是指那些能诱发基因突变、并使突变率提高到超过自发突变水平的物理、化学或生物因子。诱变与诱变剂物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂诱变剂的种类128真菌营养体常见形态食用菌隶属于48个科，144个属

约5%属子囊菌亚门

约95%属担子菌亚门返回本节子

囊

菌麦角菌目、麦角菌科—冬虫夏草盘菌目马鞍菌科马鞍菌属—马鞍菌鹿花菌属—鹿花菌羊肚菌科、羊肚菌属—羊肚菌块菌目、块菌科、块菌属—块菌鹿花菌136真菌的生活史是指从一种孢子开始，经过萌发、生长和发育，最后又产生同一种孢子的个体发育过程。相当于高等植物从种子萌芽、生长发育到开花结实，又形成种子的过程。真菌典型生活史是从有性孢子萌发开始长成菌丝体，然后继续生长发育到一定阶段，就从营养阶段过渡到繁殖阶段；先进行无性繁殖，产生无性孢子，无性繁殖在适宜条件下可重复产生，直到最后进行有性繁殖，产生有性孢子为止。什么是真菌生活史？食用菌的生活史，除了由担孢子（或子囊孢子）生成担孢子（或子囊孢子）的有性繁殖外，另外一些通过无性孢子进行小循环。如银耳的单核菌丝或双核菌丝均可以产生酵母菌状的芽孢子，芽孢子可以在一定条件下又能萌发成单核菌丝或双核菌丝。草菇、香菇的菌丝细胞，有的细胞会增厚，形成休眠孢子—厚垣孢子，厚垣孢子在条件适宜时又萌发为菌丝体。食用菌的无性繁殖食用菌的无性繁殖有田郁夫

光帽鳞伞（5个无性小循环）：单核菌丝不经质配直接形成单核性子实体，子实体又能形成2~4个单核性担孢子，萌发成菌丝；单核菌丝直接断裂成无性的分生孢子，分生孢子萌发又成单核菌丝；双核菌丝断裂成分生孢子，萌发后成双核菌丝；双核菌丝“退化”成单核菌丝，单核菌丝质配成双核菌丝；双核菌丝脱核形成单核分生孢子，发芽为单核菌丝，接合又形成双核菌丝。人们把刚从有性孢子萌发的菌丝体称为单核菌丝体或者出生菌丝体。这种菌丝开始含多个核，后来细胞产生隔膜，使每个细胞各具有一个细胞核。单核菌丝体发育到一定阶段，两个单核菌丝的细胞质融合在一起（质配），成双核细胞，具有双核细胞的菌丝体称为双核菌丝体或次生菌丝体。由于这种双核菌丝的细胞核来自不同的细胞，因此又名为异核体。食用菌的有性繁殖双核菌丝体的菌丝比单核菌丝体的菌丝粗，生长速度也快。此外，双核菌丝体还具有锁状联合结构，大多数食用菌就是通过锁状联合不断分裂细胞而生长的。双核菌丝体在适宜的温度、营养、水分、光照等条件下，能相互扭结结成团，发育成原基。原基是子实体的“胚胎”，进一步发育成子实体。食用菌的有性繁殖子实体虽然已经有组织分化（分为菌盖、菌柄、菌髓、子实层等），但它们都是由双核菌丝组成的，只是处在子实层中的部分细胞，在子实体发育成熟时，二核会合并（核配）成一个核，这样，两个单倍体的核就融合成一个双倍体的合子（2n）。随后，合子通过一次减数分裂及1~2次有丝分裂，染色体减半，最终形成4个担孢子或者8个子囊孢子，从而又开始了它新一代的生活。食用菌的有性繁殖担孢子的形成次生菌丝顶胞核配担子（2n)减数分裂担孢子（n)返回本节返回本节减数分裂核配质配质配同宗结合异宗结合担孢子有性繁殖不同种食用菌在两条单核菌丝质配成双核菌丝时，出现两种不同类型：同宗接合和异宗接合。同宗接合：单核菌丝属“雌雄同株”。即质配发生在由同一个孢子萌发的单核菌丝间，这种现象称为同宗接合。属于同宗结合的约占整个食用菌总数的10%。如双孢菇、草菇、蜜环菌等。异宗接合：单核菌丝属“雌雄异株”。这类食用菌的性别出现在不同孢子或单核菌丝上，只有异性的单核菌丝才能质配成双核菌丝，而同性间永不亲和、结实（指产生有性孢子）。这种现象称为自交不育或异宗接合。如香菇、糙皮侧耳、羊肚菌、木耳、毛木耳和大肥菇等。异性单核菌丝间的接合，是由性基因决定的。在异宗接合担子菌中约有37%的食用菌，其性别只有一对性基因（“Aa”）决定，因此它们的担孢子不是A型，便是a型，称为二级性。另有63%的异宗接合菌，其性别是由两对独立分离的遗传因子（“Aa”“Bb”）决定，其担孢子的性基因分别为“AB”、“Ab”、“aB”、“ab”四型，即4个担孢子分别属于4种基因型，称为四级性。异宗结合的菇类，只有两条性别不同的初生菌丝才能结合配对，又分为二极性和四极性异宗结合两种类型。二极性异宗结合的菇类，其性别由一对遗传因子Aa所决定，只有含A因子的单核菌丝才能和含a因子的单核菌丝结合配对，属于这种类型的有滑菇、木耳，光帽鳞伞以及鬼伞属的一些种，约占食用菌总数的33％。异宗接合的二级性四极性异宗结合的菇类，其性别由两对独立分离的遗传因子Aa、Bb所决定，只有所含的AB两个因子都不相同的两条单核菌丝才能结合，含AB因子的单核菌丝只能和含ab因子的单核菌丝结合配对，含Ab因子的单核菌丝只能和含aB因子的单核菌丝结合配对，属于这些类型的有香菇、毛木耳、平菇、银耳等，约占食用菌总数的57％。异宗结合的菇类，其单孢菌株经配对后，才能产生子实体。异宗接合的四级性总结：如果让各担孢子萌发的单核菌丝自由配对，二级性的能育率为50%，四级性的能育率为25%。第二节诱变剂及其诱变机制2.1物理诱变剂2.2化学诱变剂2.3生物诱变剂通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。诱发突变(inducedmutation)的发现1927年，Muller

用X射线诱发果蝇遗传性状变异。在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变异，其效应与X射线相类似。陆续发现许多物理因子与化学物质都具有诱发基因突变的作用。近年来，随着基因工程技术的不断发展，蛋白质工程中点突变的重要技术——基因诱变在菌种选育中得以应用，使生物诱变剂受到了重视，取得了可喜的发展。诱变：诱变剂种类物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质诱变剂的概念与种类什么是诱变剂？有哪些分类？2.1物理诱变剂1.物理诱变剂种类2.物理诱变剂的生物学效应3.辐射引起生物效应的因素4.非电离辐射——紫外线5.电离辐射6.近年来发展的新型诱变剂2.1.1

物理诱变剂的种类物理辐射电离辐射产生正离子非电离辐射不产生离子X射线0.06~136nmγ射线0.006~1.4nm紫外线136~390nm物理诱变剂包括：紫外线，X射线，γ射线，快中子，α射线，β射线，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙射线等。指的是能量以电磁波或粒子（如阿尔法粒子、贝塔粒子等）的形式向外扩散。高能电磁波波长短于紫色光的肉眼不可见“光线”辐射2.1.2物理诱变剂的生物学效应1.辐射作用的时相阶段：物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程，通常可分为物理、物理－化学、化学和生物学四个阶段。2.分子结构变化:由辐射引起DNA分子结构变化中最常发生的是DNA单链或双链断裂：单链断裂：多于双链断裂，易被修复系统修复。双链断裂：一部分也可以通过修复系统修复，但双链断裂易使染色体发生畸变或者使微生物死亡。2.1.2物理诱变剂的生物学效应3.生物学效应与辐射类型的关系电离辐射：主要引起DNA上的基因突变和染色体的畸变。非电离辐射：主要导致形成嘧啶二聚体。与辐射剂量的关系引起微生物的变异或死亡与辐射剂量成正比在相同的总辐射剂量的条件下，不论是一次连续照射还是分次累加照射，也不论是高剂量短时间照射还是低剂量长时间照射，其诱变效应基本上是相等的。2.1.2物理诱变剂的生物学效应4.辐射作用机制直接物理作用假说间接化学作用切尔诺贝利核爆炸2011年3月11日爆发的9.0级特大地震影响，日本福岛核电站反应堆发生氢气爆炸2.1.3辐射引起生物效应的因素

辐射引起生物学效应的强弱既决定于微生物内在遗传因素，也受外界环境条件的影响。微生物因素:1.微生物的遗传背景:不同菌种由于遗传性状各异，对辐射的敏感性亦各不相同。如：A和T比例高，对紫外线越敏感，对电离辐射则相反。2.微生物的生理状态：微生物细胞壁结构、修复系统的强弱环境因素:1.可见光：能激活光复活酶的活性，分解紫外线引起的嘧啶二聚体2.水分：含水量影响细胞对辐射的敏感性，如：含水酵母比干酵母敏感3.温度：较高的温度能促进氧气与自由基之间的作用,使射线与DNA接触过程所引起的化学反应加速4.空气或氧气：有氧比缺氧时的电离辐射效应更好2.1.4非电离辐射——紫外线136-390nm2.1.4非电离辐射——紫外线紫外线可由紫外灯管产生。要求的设备简单、操作方便、价格低廉。紫外线诱变效果显著。诱变频率高，而且不易发生回复突变。因此紫外线是一种使用最早也是沿用最久的应用效果最明显的物理诱变剂。DNA分子能吸收紫外线光谱。其中嘧啶碱基比嘌呤碱基敏感上百倍。紫外线使DNA分子发生如下几种变化：①DNA与蛋白质交联；②胞嘧啶和尿嘧啶之间的水合作用；③DNA链的断裂；④形成嘧啶二聚体。这是紫外线引起的主要变化。2.1.4非电离辐射——紫外线紫外线的诱变机制和DNA损伤修复单链上的二聚体会影响到复制时的碱基正常配对。双链上的二聚体会阻碍双链的分开，复制到这一点就无法继续进行，造成DNA链的异常。紫外线的诱变机制形成嘧啶二聚体DNA损伤修复光修复,

切补修复（暗修复）2.1.4非电离辐射——紫外线2.紫外线诱变(1)紫外线的有效光谱DNA吸收的紫外线光谱通常为260nm，因此能诱发微生物突变的紫外线的有效波长范围是200～300nm，最有效的波长为253.7nm(2537Å)。一般用来灭菌消毒的30W紫外灯管，光谱分布范围广，诱变效率较差；而15W紫外灯管产生的紫外线大约有80％波长集中在2537Å，因此诱变效应比30W的好。(2)紫外线的辐射剂量绝对剂量：单位用erg/mm2(1erg=10–7J)，需要用一种剂量仪来测定，由于操作比较困难，实际工作中应用较少。相对剂量：单位用照射时间或杀菌率表示剂量决定于紫外灯的功率、灯管与被照射微生物的距离及照射时间。在灯的功率和灯管的距离固定的情况下，剂量大小则由照射时间决定。用紫外线的杀菌率表示时，一般认为90～99.9％效果较好。2.1.4非电离辐射——紫外线(3)紫外线照射的策略：最适剂量因微生物而异，紫外照射剂量与杀菌率在一定范围内成正比。①使用15W紫外灯2支，安装于镀铬灯罩内，使2537Å光波集中于被处理的微生物细胞，可以提高变异率。②将照射剂量提高到超致死量的程度，与可见光交替进行，利用光修复使损伤的细胞恢复，减少死亡率，增加变异幅度。一般采用30W紫外灯管，光复活的效果较好，或者在预培养基中增加一定量的咖啡因或蛋白胨，也可以降低死亡率。2.紫外线诱变2.1.4非电离辐射——紫外线(4)紫外线诱变的步骤与方法①出发菌株：把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟。②前培养：营养丰富的培养基+抑制修复物质，如咖啡碱或异烟肼等。霉菌、放线菌培养到绝大部分孢子刚刚萌发。③制备菌悬液：离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，分散程度达90~95%。要求菌悬液浓度：细菌约1×108个/毫升，放线菌107~108个/毫升，霉菌约106~107个/毫升。2.紫外线诱变2.1.4非电离辐射——紫外线2.紫外线诱变④紫外线照射：紫外灯预热20min，以稳定光波，边搅拌边照射，细胞均匀吸收紫外线。为避免光修复，在照射的过程中要在暗室完成，仅可打开黄色或红色灯。另据国外报道，经过紫外线诱变后的菌体可以转入到无菌试管内，并立即浸入冰水中1~2h，在低温的条件下，细胞内参与突变修复的各种酶类的活性受到抑制，使修复难以进行。⑤后培养：照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5~2h。有些微生物在此阶段还可加入酪素水解物、色氨酸或异烟肼等物质来抑制修复。⑥稀释涂皿：后培养物，作不同程度的稀释，进行涂板培养和筛选。2.1.5电离辐射1.电离辐射的种类、特性与来源X射线波长是0.06~136纳米，X射线一般由X光机产生。γ射线的波长是0.006~1.4纳米，γ射线来自放射性元素钴、镭或氡等。中子可以从回旋加速器、静电加速器或原子反应堆中产生快中子具有的能量最高，为0.2~10MeV电离辐射诱变机理

直接作用：打断化学键间接作用：通过自由基打断化学键，引起缺失和损伤效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变2.1.5电离辐射2.电离辐射的诱变机理2.1.5电离辐射3.电离辐射剂量X射线和γ射线剂量常用伦琴(R)表示，即1cm3干燥空气在0℃，1.013×105Pa产生2.08×109离子时所需的能量。其作用机理是使原子中的电子被击出而变成正离子。由于具有很强的穿透能力，所以对细胞的杀死作用比紫外线和一般化学试剂更强。在实践中不用象紫外线那样进行反复多次照射。常用剂量掌握在杀菌率90～99.9％为宜，大约1万～20万R。2.1.5电离辐射3.电离辐射剂量快中子剂量常用拉德(rad)表示，指1g被照射物质吸收100erg辐射能量的射线剂量；可转换为伦琴(R)。在诱变育种中快中子照射的致死率为50～85％较合适，产生的正突变率可达50%，采用的诱变剂量大约在15～30krad。其作用机理是由中子穿过物质时把原子核中的质子撞击出来。由于快中子产生较大的电离密度，能有效地导致基因突变和染色体畸变，所以快中子对微生物诱变育种是较理想的。2.1.5电离辐射4.电离辐射的照射方法直接对平皿上生长的菌落进行照射；用打孔器将菌落连琼脂一同取出，置于灭菌平皿内进行照射；制成菌悬液，取1～2ml置于试管内，浸入冰水中，从上、侧或下面进行短时间照射。低温可以降低或抑制修复酶的活性，防止突变体因修复酶的修复而还原为正常细胞。2.1.5近年来发展的新型诱变剂1.微波：热和非热效应，分散低温干燥法消除微波热效应。2.红外射线3.激光：光量子流，光微粒。4.高能电子流：较强的电离辐射线，剂量一般为杀菌率90-99.9%5.离子注入优点1：离子束与生物体作用，不仅有能量沉积，而且同时有质量沉积。能量沉积：注入的离子与生物大分子发生一系列碰撞，大分子生物获得能量时，键断裂，分子击出原子位，留下断键或缺陷，而注入离子逐步损失能量，直到能量低于100eV为止。质量沉积：注入的离子与生物大分子结合成新分子。优点2：由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，可提供众多的诱变条件。优点3：离子注入具有作用区域的选择性、种类的多样性，其作用是局部的、可控的、可对生物体进行定点区域诱变。化学诱变剂也可借用电离辐射的方法。试管中所盛液体不能过多，否则氧气供应不足，诱变效应和重复性都比较差。电离辐射的穿透能力比较强，可以穿透玻璃等材料，而紫外线则不能穿透普通的玻璃，诱变时必须打开盖子。值得注意的事2.2化学诱变剂2.2.1化学诱变剂的一般特点2.2.2化学诱变剂的类型:

碱基类似物烷化剂脱氨剂移码诱变剂羟化剂金属盐类其他化学诱变剂2.2.1化学诱变剂的一般特点化学诱变剂往往具有专一性，对基因的某部位发生作用，对其余部位则无影响。化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。绝大多数化学诱变剂都具有毒性。定义：一类能对DNA起作用，改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质。

在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进DNA分子它们产生异构体的频率高，出现碱基错配的概率也高碱基类似物是如何提高突变频率的?2.2.2碱基类似物2.2.2碱基类似物1.碱基类似物的诱变机制以5－溴尿嘧啶(5-BU)为例碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基掺入到DNA分子中的一类化合物。主要诱变剂：5-溴尿嘧啶（5-BU）/T2-氨基嘌呤（2-AP）/A187

G≡CG≡BUeG≡CG≡BUeG≡CA=TA=BUk

A:TA:BUk

A:TG≡BUeA:TG≡CG≡BUeG≡C→A=T5-BU掺入错误A:T→G≡C从上可知，由于5-BU分子结构上的5位Br原子的存在，改变了电荷的分布，影响酮式和烯醇式的平衡。2.2.2碱基类似物2.碱基类似物的诱变处理方法(以5-BU为例)(1)单独处理(2)与辐射线复合处理斜面细菌液体培养至对数期饥饿培养8-10h琼脂平板涂布培养移接去培养液加生理盐水加5-BU25-40μg/ml

据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用辐射线更好。因此，碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂。真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.1—1mg/ml），加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般6—12h)——分离于平皿——适温培养——挑取单菌落，进行筛选。189

2.2.3化学修饰碱基的诱变剂（a）亚硝酸（b）羟胺（c）甲基磺酸乙酯（d）N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍改变碱基结构的化学修饰剂：脱氨剂、羟化剂、烷化剂常见的碱基修饰剂烷化剂烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂，具有一个或多个活性烷基，易取代DNA分子中活泼的氢原子，与一个或多个碱基起烷化反应，改变DNA分子结构，引起突变。双功能烷化剂单功能烷化剂多功能烷化剂根据烷化剂中活性烷基的数目亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、重氮烷类、乙烯亚胺类化合物硫芥子、氮芥子类等1.烷化剂定义与种类烷化碱基部分烷化剂2.部分烷化剂和烷化碱基甲基磺酸甲酯亚硝基乙基脲7-甲基鸟嘌呤3-甲基腺嘌呤O6-甲基鸟嘌呤烷化剂烷化剂1.烷化剂的作用机制(1)烷化剂主要通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分被烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。易发生烷化的位点：鸟嘌呤O6、胸腺嘧啶O4。其它位点：鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2和N7

、胞嘧啶N3。(2)烷化剂还可引起DNA分子中磷酸和糖之间的共价键断裂，而造成突变。烷化剂(3)烷化剂还可能使两个鸟嘌呤N7位点形成共价键。(4)一般双功能烷化剂容易引起DNA双链间的交联，造成变异或死亡。1.烷化剂的作用机制烷化剂2.烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解。见光容易发生光化学反应，保藏时要注意避光。杀菌率低而诱变效应高，如亚硝基类、磺酸酯类等。烷化剂3.常用的烷化剂(1)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变株。酸碱条件影响NTG的诱变效果，配制NTG溶液和菌悬液都要用适宜的缓冲液，如磷酸或Tris缓冲液。pH<5.5，NTG分解成HNO2；pH>8.0，NTG分解产生重氮甲烷；pH=6.0，NTG本身和DNA起烷化作用。1.取新鲜的斜面，用一定pH值的缓冲液或Tris缓冲液洗下细菌制成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子（真菌或放线菌）须进行前培养，可用有关培养基代替以上缓冲液，孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动阶段，经离心、洗涤，用缓冲液制成悬液，浓度约在106-107mL-1；NTG的诱变处理方法：烷化剂3.常用的烷化剂(1)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)2.配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲溶液，其比例为9：1（缓冲溶液9ml：NTG丙酮溶液1ml），一般NTG母液浓度配成1mg/ml。使用时取母液0.2ml，加菌悬液1.8ml，NTG最后处理浓度为100μg/ml。一般处理浓度随菌种不同而异，通常细菌为100—1000μg/ml，而放线菌、真菌孢子为1000—3000μg/ml。3.将以上菌悬液和NTG溶液混合于一试管内，置该菌生长适宜的温度下保温处理若干时间。烷化剂3.常用的烷化剂(1)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)4.终止反应。用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度分离于平皿。处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡处理。除以上直接以溶液处理外，也可以进行如下方法诱变处理：1.摇瓶振荡处理2.在平皿上生长过程处理烷化剂3.常用的烷化剂(1)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)NTG是一种强烈的致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例如用自来水大量冲洗或用1—2mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡过夜，洗净。烷化剂3.常用的烷化剂(1)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)烷化剂(2)甲基磺酸乙酯(EMS)水溶液中水解半衰期短，应现用现配；需低温、干燥保存；诱变效应最佳的酸碱条件为pH7.0～7.4；配制EMS和菌悬液需缓冲液，不仅影响诱变剂渗透到细胞内的速度，还影响诱变剂的稳定性。(3)硫酸二乙酯(DES)不溶于水，溶于乙醇，很不稳定；水溶液中半衰期很短，随用随配，需低温、干燥、避光保存；DES诱变效应在pH中性时效应最好。(4)乙烯亚氨溶于水，不稳定易分解，易挥发，有强烈腐蚀作用，易燃易爆，需避光、密封、低温保存；能与一个或多个碱基起化学反应，引起DNA复制时碱基错配而发生变异；在水溶液中易产生无诱变作用物质，最好采用高浓度短时间处理。3.常用的烷化剂脱氨剂(以亚硝酸为例)1.诱变机制脱氨基作用引起DNA两条单链之间的交联作用亚硝酸（nitrousacid）是典型的脱氨剂亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子，脱去碱基中的氨基变成酮基，改变碱基氢键的电位，引起碱基转换而发生变异。脱氨剂(以亚硝酸为例)2.亚硝酸的处理方法(1)试剂配制1mol/LpH4.5醋酸缓冲液0.1mol/L亚硝酸钠溶液0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液(2)处理方法处理对象亚硝酸钠溶液处理浓度温度处理时间终止反应(加入磷酸氢二钠溶液)孢子悬液0.025mol/L25～26℃10～20minpH降至6.8细菌悬液0.05mol/L35～37℃5～10minpH降至6.8移码诱变剂移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。对噬菌体有较强的诱变作用；诱发细菌、放线菌的质粒脱落比其他诱变剂效果更显著。吖啶化合物的诱变机制：与DNA结合后，DNA链拉长，两碱基距离拉宽，使碱基插入或缺失。吖啶黄的性质和使用方法微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳定，需避光保存。羟化剂羟胺（hydroxylamine）是典型的羟化剂羟胺的分子式为NH2OH（简称HA）,常以盐酸羟胺形式存在（分子式为NH2OH·HCl），为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性，容易吸湿，故要密封、干燥保存。羟胺是具有特异效应的诱变剂，专一地诱发G:CA:T的转换。羟化剂羟胺的诱变机制改变了结构的胞嘧啶羟化剂

根据诱变机制，羟胺不能使突变回复，即不能使A:TG:C转换，进行逆向突变。由于羟胺是诱发G:CA:T的专一性诱变剂，因此，可以用来鉴别突变体是A:TG:C还是G:CA:T转换。羟胺的处理方法：常用浓度为0.1—5%，可直接在溶液中处理，时间1—2h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度比直接处理时低些。金属盐类用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。氯化锂单独使用没有明显的诱变效果，几乎都要与其他诱变剂配合处理，因此也称为助诱变剂。它在高产菌种选育史上发挥了极其显著的作用。其他化学诱变剂1.秋水仙碱：是诱发细胞染色体多倍体的诱变剂。自1937年美国学者布莱克斯利（A.F.Blakeslee）等，用秋水仙素加倍曼陀罗等植物的染色体数获得成功以后，秋水仙素就被广泛应用于细胞学、遗传学的研究和植物育种。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期，使具备两套染色体的母细胞无法分裂，导致多倍体产生。2.抗生素：作为诱变剂的抗生素主要有链黑霉素，争光霉素，丝裂霉素，放线菌素，正定霉素，光辉霉素和阿霉素等。都是抗癌药物，效果不如烷化剂，应用不广泛。重视化学诱变剂的操作安全诱变剂在DNA上的初级效应遗传反应碱基类似物掺入作用AT↔GC转换羟胺同胞嘧啶起羟化反应GC→AT转换亚硝酸A、C的脱氧基作用

DNA交联AT→GC转换

缺失烷化剂烷化碱基（主要是G）而导致：

脱嘌呤作用；烷化碱基的互变异构作用；DNA链的交联作用；糖-磷酸骨架的断裂碱基置换（AT↔GC转换、AT→TA颠换、GC→CG颠换）及染色体畸变吖啶类个别碱基的插入或缺失移码突变紫外线照射形成嘧啶二聚体；形成嘧啶的水合物；DNA交联；DNA断裂AT→GC转换、AT→GC颠换、

及移码突变电离辐射脱氧核糖-碱基之间化学键及脱氧核糖-磷酸之间化学键的断裂；通过自由基对DNA的作用AT↔GC转换、移码突变及染色体畸变小结2.3生物诱变剂噬菌体基因定点诱变剂生物诱变剂的主要诱变方式2.3.1噬菌体采用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常常发现伴随着出现抗生素产量明显提高的抗性突变株。因此，可以认为这些溶源性噬菌体是一种生物诱变剂。2.3.2基因定点诱变随着基因工程技术的发展，点突变技术在蛋白质工程中正得到广泛应用，特定寡核苷酸在突变技术中起着介导作用，使基因成为一种新的分子水平生物诱变剂。寡核苷酸介导的定点诱变2.3.3生物诱变剂的主要诱变方式1.转导诱发突变概念：经完全或部分缺馅噬菌体的媒介，将供体菌的小片段DNA携带至受体菌中，经配对、双交换后整合至供体菌内而获新的遗传性状之现象。烈性噬菌体：随机转导，宿主细菌的基因型发生改变；温和噬菌体：特定转导，使供体菌和受体菌都产生基因突变。2.3.3生物诱变剂的主要诱变方式2.转化诱发突变

供体菌：由细胞自溶等释放DNA片段；受体菌：直接吸附并吸收供体菌DNA片段；在体内：经配对、交换与整合成为自体基因组的部分，再经复制形成一个转化子.

感受态：转化中受体细胞最易接纳外源DNA片段的一种生理状态。2.3.3生物诱变剂的主要诱变方式1.转导诱发突变烈性噬菌体：随机转导，使宿主细菌的基因型发生改变；温和噬菌体：特定转导，也能使供体细菌和受体细菌都产生基因突变。2.转化诱发突变3.转座诱发突变转座因子是在染色体组中或染色体组间不断改变自身位置的一段DNA序列基因定点诱变PCR定点诱变课堂讨论诱变剂在微生物育种中的作用和地位如何？诱变剂都有哪些效应？紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体对微生物有何影响？哪些修复系统可对此进行修复，其结果如何？试述各种诱变剂的作用机制。思考题1四种常用的物理诱变剂的诱变机制和生物学效应是什么？2紫外线照射剂量的表示方法有哪些？3简述紫外线诱变的过程。4哪些因素会影响化学诱变剂的诱变效应？5如何用营养缺陷型回复突变测定法定性定量地测定某种化学物质的诱变作用？今日话题太空育种太空育种即航天育种，也称空间诱变育种，是将作物种子或诱变材料搭乘返回式卫星或高空气球送到太空，利用太空特殊的环境诱变作用，使种子产生变异，再返回地面培育作物新品种的育种新技术。第三章菌种的分离和鉴定222第三章菌种的分离和鉴定第一节纯种的分离第二节母种的鉴定（二）种菇的选择

选择什么样的种菇呢？（1）选取符合本品种典型特征的个体；（2）要在出菇早、出菇均匀、生长旺盛的菇木和菇床上挑选；（3）选朵型正常，菌盖肥厚，菌柄短壮，无病虫害；（4）野生菇木的选择应选出菇多而无杂菌生长的幼龄菇木。（三）纯种的分离

常用的分离方法有：组织分离法、孢子分离法和菇木分离法。1.组织分离法

（1）选种菇：菇型正常、发育健壮、中等成熟的平菇子实体，（2）种菇消毒：用75%酒精棉球擦拭表面，在接菌箱内掰开。（3）取组织：用接种针在菌盖和菌柄交界部位中间挑取一小块组织放在试管的斜面培养基中部，在25℃的恒温箱中培养，即可萌发形成菌丝，再经提纯移接于新的斜面培养基上扩大培养即成母种。（2）孢子分离法

此法为直接挑取担孢子培养或者通过孢子收集器收集孢子，然后在培养基上培养，获得母种。利用孢子收集器分离孢子流程图15432孢子印法分离孢子流程图163425（3）菇木分离法

（1）将已长菇的木段带回实验室，晾干，轻轻敲掉沾附的土和杂物；（2）剥掉树皮，削去表层木质部。（3）选取菌丝洁白、浓密的部位切取菇木的中间部位，然后锯成3cm厚的薄片。带有菌丝的木块即为分离材料，带进无菌室进行分离。（4）取选好的菇木小薄片，用75%酒精擦洗表面消毒，之后放入0.1％的升汞内消毒1～2min，再用无菌水洗去升汞残液。随后将其截成如火柴梗大小的小木条，移接在斜面培养基中央。经25～27℃恒温培养，待菌丝生长后，再行转管培养。菇木分离示意图（四）母种培养与选择

将分离得到的菌种接入试管后，放入25℃的培养箱中培养。采用组织分离法和菇木分离法，2~3天即看到菌丝生长，孢子分离法须一周左右才能用肉眼看到孢子萌发。此时即应检查菌丝生长情况，淘汰污染的及未萌发菌丝的试管，挑选菌丝发育健壮的试管分离扩大培养，即为平菇纯菌种（母种）。灼烧接种针剖菇体取组织接种后（五）母种的鉴定培养

培养好母种后，除用肉眼观察菌丝长势强弱外，还应做好瓶栽出菇试验。将母种接到装有灭菌棉籽皮或木屑培养基的菌种瓶内，置于25℃恒温箱中培养。菌丝长满瓶子后，置于15～18℃有光亮的地方培养。观察子实体生长情况，选择长势旺、出菇快而多的株系扩大制种。分子水平鉴定是指利用生物可遗传并可检测的分子特征对生物的种类、品系等进行鉴定。可用于鉴别的分子特征也被称为分子标记。分子水平鉴定中所利用的分子标记主要有以下几种：rDNA序列分析、同工酶分析、RFLP、SSR、RAPD、SRAP、SCAR、和ITS等。第二节母种的分子鉴定核糖体RNA基因（rRNA）序列分析被认为是最能反应物种遗传关系的指标之一。原因是：（1）核糖体在细胞生物体中是一种十分常见，存在着共同的遗传进化起源,可比性强。（2）编码rRNA的基因序列（rDNA）中,有的进化上比较保守,有的进化上变异较大。（3）核糖体在细胞中的数量巨大,编码核糖体的基因在单个生物体细胞基因组中占很大比例。由于以上三个原因，rDNA的提取、提纯、分析也比其他基因序列易于操作。第二节母种的分子鉴定原核生物的rRNA分三类：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA。真核生物的rRNA分四类：5SrRNA、5.8SrRNA、18S

rRNA和28S

rRNA，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。S为大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位，可间接反映分子量的大小。原核生物和真核生物的核糖体均由大、小两种亚基组成。对于大多数真核生物来说,

核糖体rRNA基因群的一个重复单位(rDNA)包括以下区段(按5′→3′方向):①非转录区(NonTranscribedSequence),简称NTS;②外转录间隔区(ExternalTranscribedSpacer),简称ETS;③18SrRNA基因,简称18SrDNA;④内转录间隔区1(InternalTranscribedSpacer1),简称ITS1;⑤5.8SrRNA基因,简称5.8SrDNA;⑥内转录间隔区2,简称ITS2;⑦28SrRNA基因,简称28SrDNA。ITS1和ITS2常被合称为ITS,并且5.8SRNA基因也被包括在ITS之内。核糖体内转录间隔区包含2个不同的非编码区域,即ITS1和ITS4。ITS序列在物种属内、近缘属间乃至科内系统进化关系研究中有一定的价值。真菌核糖体基因由小的亚单元(18S)、ITS1区、5.8S区、ITS2区和大的亚单元(28S)构成,头尾串联形成重复序列,一个基因组内有60～200个拷贝。ITS（internaltranscribedspacers）内部转录间隔区，是一种基于特异引物扩增的分子标记，由于真核生物rDNA的重复片段中，ITS区进化速度较快,适合作遗传标记进行种群和同属近缘种群及种类的系统发育分析,在ITS两侧的18S、5.8S、28S编码区具有非常保守的区域，便于设计引物。目前大多采用ITS2作为分子标记,通过特异物对ITS2区进行PCR扩增,克隆测序，最后利用测序结果来作为分子标记。第二节母种的分子鉴定同工酶是指能催化同一种反应,但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。同工酶标记既是一种生化标记,还由于同工酶的氨基酸取代作用为相应所编码,因此可以看作是一种分子标记。RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorph