1.2.2微生物的选择培养和计数

第1章发酵工程第2节二、微生物的选择培养和计数学习目标必备知识一、微生物的选择培养二、微生物的数量测定三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数拓展延伸高考链接模拟演练阐明微生物选择培养的原理2.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数一、微生物的选择培养1.选择培养基（1）概念：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基（2）原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。2.自然界中目的菌的筛选（1）实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的水生栖热菌中提取出来的。70～80℃3．微生物的选择培养(1)方法：对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。(2)稀释涂布平板法的操作过程①系列稀释操作a．编号为1×102～1×107试管中分别盛有9mL无菌水。b．将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。c．取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。②涂布平板操作A.取菌液：取0.1mL菌液，滴加到培养基表面B.涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中C.涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布D.涂布平板：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀(3)培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d。微生物的数量测定1.稀释涂布平板法①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②计数原则：一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。③计算公式每克样品中的菌株数＝eq\f(某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,涂布平板时所用的稀释液的体积mL)×稀释倍数2.显微镜直接计数法一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。三、微生物的纯培养1.实验原理：①土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。②配制以尿素为唯一碳源的培养基，能够在该培养基中生长的细菌就是能分解尿素的细菌2．实验设计(1)土壤取样①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。②取样部位：距地表约3～8cm的土壤层。(2)样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。(3)微生物的培养与观察①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。②观察a．观察方法：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。b．记录菌落的特征：包括菌落的形状、大小和颜色等。3．操作提示(1)无菌操作：取土样的用具在使用前都需要灭菌。(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。4.实验结果分析与评价内容现象结果分析是否有杂菌污染对照组的培养基上无菌落生长未被杂菌污染对照组的培养基上有菌落生长被杂菌污染选择培养基是否具有筛选作用选择培养基上的菌落数目明显少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目。选择培养基具有筛选作用样品的稀释操作是否成功得到2个或2个以上的菌落数为30~300的平板操作成功重复组的结果若选取的是同一种土样，统计的结果应该接近5.菌种鉴定：分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。1．稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的比较项目稀释涂布平板法显微镜直接计数法主要用具培养基等显微镜、血细胞计数板或细菌计数板等计数依据培养基上的菌落数菌株本身优点计数的都是活菌计数方便、操作简单缺点操作复杂、有一定误差死菌、活菌都计数在内2．选择培养基的类型类型条件分离得到的菌种改变培养条件70～80℃的高温水生栖热菌添加某种化学物质加入青霉素酵母菌、霉菌等真菌高浓度食盐金黄色葡萄球菌特殊碳源、氮源石油是唯一碳源能消除石油污染的微生物营养缺陷不加碳源自养型微生物不加氮源固氮菌3.两种纯化方法的比较项目平板划线法稀释涂布平板法主要步骤接种环在固体培养基表面连续划线等比稀释操作和涂布平板操作接种工具接种环涂布器单菌落的获得从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落用途分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落；②用于计数菌落分布共同点都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征4.选择培养基与鉴别培养基项目选择培养基鉴别培养基特殊成分加入某种化学物质加入某种指示剂或化学药品目的抑制或阻止其他微生物生长，促进目的微生物生长与微生物的代谢物或培养基中的成分发生特定反应用途培养、分离出特定微生物鉴别不同的微生物举例培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并有金属光泽)【例1】（2023·辽宁·统考高考真题）细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度（菌落数/m³）。下列叙述错误的是（

）A．采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理B．细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置C．同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值D．稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高【答案】D【分析】稀释涂布平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。【详解】A、为防止杂菌感染，接种前需要对培养基、培养皿、微生物采样器进行灭菌，对实验操作者的双手进行消毒，A正确；B、纯化培养时，为防止污染培养基和水分蒸发，培养皿应倒置放在恒温培养箱内培养，B正确；C、微生物计数时在同一稀释度下，应至少需要对3个菌落数目在30～300的平板进行计数，以确保实验的准确性，C正确；D、使用稀释涂布平板法对微生物计数，数值往往偏小，原因是两个或多个细胞连在一起时，在平板上只能观察到一个菌落，D错误。【变式11】（2023·江苏·统考高考真题）下列关于细菌和酵母菌实验的叙述正确的是（）A．通常酵母菌培养基比细菌培养基有更高的碳氮比B．通常细菌的生长速度比酵母菌快，菌落比酵母菌落大C．通常细菌培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌，酵母菌培养基用过滤除菌法除菌D．血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定【答案】A【分析】培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。灭菌常用的方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。消毒常用的方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法等。【详解】A、细菌是原核生物，酵母菌是真核生物，不同微生物对营养物质的需求是不一样，通常酵母菌培养基比细菌培养基有更高的碳氮比，A正确；B、通常细菌的生长速度比酵母菌快，但形成的菌落，不一定细菌的大于酵母菌的，与细菌的种类有关，部分细菌的菌落小于酵母菌，B错误；C、通常细菌和酵母菌的培养基都可以用高压蒸汽灭菌法灭菌，C错误；D、血细胞计数板适用于真菌的计数，细菌计数板用于细菌的数量测定等，D错误。【变式12】（2023·广东·统考高考真题）研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线（如图）和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是（

）A．a点时取样、尿素氮源培养基B．b点时取样、角蛋白氮源培养基C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基D．c点时取样、角蛋白氮源培养基【答案】D【分析】筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，要用角蛋白氮源培养基。【详解】研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，所以D正确，ABC错误。故选D。【例2】（2023·山东·高考真题）平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是（

）A．不含氮源的平板不能用于微生物培养B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物【答案】D【分析】1、培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。2、按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。3、消毒和灭菌是两个不同的概念，消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物的方法杀死物体表面或内部的一部分微生物。灭菌则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。【详解】A、不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；B、平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；C、使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；D、脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。故选D。【变式21】（2022·江苏·统考高考真题）下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是（

）A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌【答案】D【分析】为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上能生长，其它微生物在该培养基上因缺乏氮源而不能生长，可用于分离含脲酶的微生物。【详解】A、农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A正确；B、为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；C、当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；D、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。故选D。【变式22】（2022·湖南·高考真题）黄酒源于中国，与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒。发酵酒的酿造过程中除了产生乙醇外，也产生不利于人体健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素与乙醇反应形成，各国对酒中的EC含量有严格的限量标准。回答下列问题:(1)某黄酒酿制工艺流程如图所示，图中加入的菌种a是，工艺b是（填“消毒”或“灭菌”），采用工艺b的目的是。(2)以尿素为唯一氮源的培养基中加入指示剂，根据颜色变化，可以初步鉴定分解尿素的细菌。尿素分解菌产生的脲酶可用于降解黄酒中的尿素，脲酶固定化后稳定性和利用效率提高，固定化方法有（答出两种即可）。(3)研究人员利用脲酶基因构建基因工程菌L，在不同条件下分批发酵生产脲酶，结果如图所示。推测是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素，理由是。(4)某公司开发了一种新的黄酒产品，发现EC含量超标。简要写出利用微生物降低该黄酒中EC含量的思路。【答案】(1)酵母菌消毒目的是杀死啤酒的中大多数微生物，并延长其保存期(2)酚红化学结合法、包埋法、物理吸附法(3)pH两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，而维持pH在6.5不变与pH从6.5降为4.5相比较而言，酶活力值始终要高(4)方案一：配置一种选择培养基，筛选出产生EC降解酶的细菌，从细菌中分离得到EC降解酶，纯化的EC降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。方案二：配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定化操作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。【分析】由于细菌分解在尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，pH升高，所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，可在培养基中加入酚红指示剂，尿素被分解后产生氨，pH升高，指示剂变红。【详解】（1）制造果酒利用的是酵母菌的无氧呼吸，加入的菌种a是酵母菌。过滤能除去啤酒中部分微生物，工艺b是消毒，目的是杀死啤酒的中大多数微生物，并延长其保存期。（2）由于细菌分解尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，pH升高，所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，故在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可以鉴别尿素分解菌。固定化酶实质上是将相应酶固定在不溶于水的载体上，实现酶的反复利用，并提高酶稳定性，酶的各项特性（如高效性、专一性和作用条件的温和性）依然保持。固定化酶的方法包括化学结合法、包埋法、物理吸附法等。（3）对比两坐标曲线，两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，说明培养时间不是决定因素；而维持pH在6.5不变与pH从6.5降为4.5相比较而言，酶活力值始终要高，说明pH为6.5时，有利于酶结构的稳定，故pH是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素。（4）从坐标图形看，利用脲酶消除其前体物质尿素可降低该黄酒中EC含量。配置一种选择培养基，筛选出产生EC降解酶的细菌，从细菌中分离得到EC降解酶，纯化的EC降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。或者配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定化操作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。1．微生物合成的油脂是制备生物柴油的新型原料。为筛选出产油脂的细菌，某小组进行了如图所示的实验。物质甲可将菌体内的油脂染成黑色。下列分析正确的是（）A．应将土壤菌液系列稀释、灭菌后再涂布到培养基A上B．培养基A、B、C都以油脂作为唯一的碳源C．培养基B中的菌落2和菌落4是产油脂的目的菌D．挑选培养基B中的目的菌接种到固体培养基中扩大培养【答案】C【分析】选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。【详解】A、灭菌会杀死土壤菌液中的目的菌，A错误；B、该实验的目的是筛选能合成油脂的细菌，因此选择培养基中不能加入油脂，B错误；C、依据题图可知，菌落2和菌落4的细胞被染成黑色，说明这两个菌落的微生物都产生了油脂，C正确；D、一般微生物的扩大培养采用液体培养基，D错误。2．尿酸氧化酶能分解尿酸（C5H4N4O3）。为获取尿酸氧化酶高产菌株用以研制治疗高尿酸血症的酶类药物，科研人员从某泥土中取样后富集培养，3天后吸取培养液梯度稀释到106，然后接种到固体培养基上分离培养。挑取单菌落检测尿酸氧化酶的酶活力（用每分钟转化1μmol尿酸所需要的酶量表示），结果如表所示。下列最适合作为实验目的菌落的是（

）菌落1234酶活力100501420A．菌落1 B．菌落2 C．菌落3 D．菌落4【答案】C【分析】微生物分离时，利用该分离对象对某一营养物质的“嗜好”，专门在培养基中加入该营养物质，使该微生物大量增殖．这些物质主要是一些特殊的碳源、氮源，如纤维素可用来富集纤维素分解微生物，尿素可用来富集尿素分解微生物。【详解】分析题意，酶活力用每分钟转化1μmol尿酸所需要的酶量表示，故所需酶量越少，说明酶活力越大，可知菌落3的酶活力最高，可作为实验所需的目的菌，C符合题意。故选C。3．下列有关微生物培养的叙述，错误的是（

）A．涂布接种时，需将涂布器沾酒精后在酒精灯外焰上引燃，冷却后再使用B．分离计数时，可用稀释涂布平板法对需计数的微生物进行分离C．观察菌落时，不需要将培养皿盖拿掉D．培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利【答案】D【分析】稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过梯度稀释后，进行涂布接种，将涂布器沾酒精后在酒精灯外焰上引燃，待酒精燃尽、涂布器冷却后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30~300的平板进行计数。【详解】A、涂布接种时，涂布器应从盛酒精的烧杯中取出，并在火焰上引燃，冷却后再进行涂布接种，A正确；B、稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目，因此可用稀释涂布平板法对需计数的微生物进行分离，B正确；C、为防止空气中的杂菌污染培养物，观察菌落时，不能打开培养皿的盖子，C正确；D、按照微生物对营养基质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，培养基中各种营养物质的浓度适宜，对微生物的生长有利，如果营养物质浓度过高会导致微生物失水，影响其生长繁殖，D错误。故选D。4．物质Y是一种会污染土壤的含氮有机物，Y在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解Y的细菌。在筛选目的菌的培养基中观察到几个菌落（如图所示）。下列相关叙述正确的是（

）A．应首选菌落①中的菌株进一步纯化B．将所选取土壤灭菌后用无菌水稀释涂布于培养基C．图中菌落都具有能够降解Y的能力D．图中培养基可用牛肉膏、蛋白胨配制【答案】A【分析】筛选培养基是指根据某种微生物的特殊营养要求或对某些化学、物理因素的抗性而设计的，能选择性地区分这种微生物的培养基。利用选择培养基，可使混合菌群中的目标菌种变成优势种群，从而提高该种微生物的筛选效率。【详解】A、据图可知，①菌落最小，周围透明圈最大，说明①菌落分解Y的能力最强，所以应该选择①菌落进一步纯化，A正确；B、土壤稀释液中含有接种的微生物，不能灭菌，B错误；C、据图可知，图中菌落③周围未形成透明圈，不能降解Y，C错误；D、实验目的是筛选出能降解Y的细菌，所以不能加入牛肉膏、蛋白胨，只能以Y作为唯一氮源，D错误。故选A。5．黄河入海口石油降解菌的筛选是修复石油污染，保护黄河的重要工作，如图表示筛选石油降解菌的过程。下列叙述正确的是（

）A．图示接种方法为稀释涂布平板法，据结果推测1g土壤中石油分解菌数最多为1.6×106个B．分离、纯化石油分解菌时，还可采用平板划线法且该方法也需要进行③步骤操作C．稀释涂布时，利用涂布器从盛有菌液的试管中蘸取菌液，进行涂布D．进行步骤⑤时，应用液体培养基培养④中的石油降解菌，并检测菌的数量和石油降解能力【答案】D【分析】1、每克样品中的菌株数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。2、常用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，其中稀释涂布平板法分离纯化土壤中微生物的步骤为土壤取样→溶化→梯度稀释→涂布平板。3、由题图可知，①称取10g土壤；②10g土壤加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中制备土壤悬浮液，稀释了101；③进行梯度稀释，即依次稀释至101、102、103稀释度；④使用稀释涂布平板法筛选菌株，接种了104稀释度菌液0.1mL，长出16个菌落；推测1g土壤中石油分解菌数=16÷0.1×104÷10=1.6×105个；⑤鉴别优质菌种，保存备用，推测使用甘油管藏法或临时保存法。【详解】A、根据题图分析可知，图示接种方法为稀释涂布平板法，涂布平板的稀释度为104，据结果推测1g土壤中石油分解菌数=16÷0.1×104÷10=1.6×105个，A错误；B、根据题图分析可知，③进行梯度稀释，虽然分离、纯化石油分解菌时，可以采用稀释涂布平板法，也可以采用平板划线法，但平板划线法不需要进行梯度稀释，也就是不需要进行③步骤操作，B错误；C、稀释涂布时，先取少量菌夜（不超过0.1ml）滴加到培养基表面，再将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却，用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，而不是利用涂布器从盛有菌液的试管中蘸取菌液，进行涂布，C错误；D、根据题图分析可知，⑤鉴别优质菌种和保存备用，无论使用甘油管藏法或临时保存法，都要应用液体培养基培养④中的石油降解菌，获得菌液，而鉴别优质菌种就是要检测菌的数量和石油降解能力，D正确。故选D。6．为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述正确的是（

）A．采样时只需采集植物园中某一地点的土壤样本B．活细菌数目可通过稀释涂布平板法和平板划线法来测定C．土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落D．可根据菌落的颜色、形态和大小来初步鉴定细菌种类【答案】D【分析】微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。【详解】A、本实验目的是探究校内植物园土壤中的细菌种类，故应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本，A错误；B、平板划线法不能用于统计活菌数目，B错误；C、土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的细菌分散开，有助于在培养基表面形成单菌落，而非稀释倍数越低越越易得到，C错误；D、不同种类细菌的菌落特征一般不同，鉴定细菌种类时，可根据菌落的颜色、形态和大小来初步鉴定细菌种类，D正确。故选D。7．下列有关微生物培养与应用技术的叙述，正确的是（）A．培养微生物所用的培养基中都必须含有水、无机盐、碳源和氮源等基本营养成分B．若要检测饮水机的直饮水中大肠杆菌是否超标,待检测水样需要经过灭菌后再检测C．采用稀释涂布平板法接种后,不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单菌落D．分离土壤中分解尿素菌纯培养后,利用含酚红的尿素培养基可作进一步鉴定【答案】D【分析】无菌技术的主要内容①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。【详解】A、自养型微生物不需要提供碳源，A错误；B、若要检测饮水机的直饮水中大肠杆菌是否超标，待检测水样需要直接进行检测，待检测水样不能进行灭菌处理，B错误；C、采用稀释涂布平板法接种后，稀释到合适的浓度的菌液才可在培养基表面形成单菌落，C错误；D、分解尿素的细菌能合成脲酶，催化尿素分解产生的NH3可以作为细菌生长的氮源。如果培养基中加入了酚红指示剂，尿素分解的产物NH3会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此，可用酚红指示剂对分解尿素的微生物进行鉴定，D正确。故选D。8．以下说法正确的是（

）A．土壤中的尿素分解菌之所以能分解尿素是因为它们能合成尿素酶B．用尿素为唯一氮源加入酚红指示剂的培养基，培养细菌后指示剂变成红色C．用尿素为唯一氮源的培养基加入酚红指示剂的目的是做细菌的营养成分D．检测土壤中细菌总数的操作时，应选择菌落数在300以上的实验组进行计数【答案】B【分析】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验中，需要使用以尿素为唯一氮源的选择培养基，计数的关键是经梯度稀释后的倍数要合适，计数时通常选择30300之间的实验组平板进行计数。【详解】A、土壤中的尿素分解菌之所以能分解尿素是因为它们能合成脲酶，A错误；B、由于细菌分解在尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，指示剂变成红色，B正确；C、酚红指示剂不能作为细菌的营养成分，C错误；D、检测土壤中细菌总数的操作时，应选择菌落数在30300之间的实验组进行计数，D错误。故选B。9．下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，正确的是（）A．实验中采集的土样经高温灭菌后，可以用于制取土壤稀释液B．测定土壤样品中的活菌数目，常用显微镜直接计数法C．分离土壤中能分解尿素的细菌时，应选择以尿素为唯一氮源的培养基D．若实验组菌落平均数为37个/平板，空白对照平板上有3个菌落，则本组菌落数的平均值为34个/平板【答案】C【分析】绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用尿素为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的微生物。稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。【详解】A、实验中采集的土样经高温灭菌后会杀死所有微生物，无法分离得到分解尿素的细菌，A错误；B、测定土壤样品中的活菌数目，常用稀释涂布平板法，B错误；C、以尿素为唯一氮源的培养基上，尿素分解菌可以分解尿素作为氮源而能存活下来，其他不能分解尿素的微生物因为缺乏氮源而无法生存，从而达到筛选、分离尿素分解菌的目的，C正确；D、空白对照平板上有菌落，说明培养基灭菌不合格，那么实验组平板上得到的菌落数据也是不准确的，D错误。故选C。10．如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图。下列叙述错误的是（

）A．步骤②的液体培养基含有的唯一氮源是尿素B．步骤③的平板培养基是加入了适量尿素的LB固体培养基C．步骤③采用稀释涂布平板法接种，期待获得能分解尿素细菌的单菌落D．步骤④挑取③中菌落分别接种，可通过溶液pH的变化比较细菌分解尿素的能力【答案】B【分析】微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养基表面，经培养后可形成单个菌落。【详解】A、步骤②为选择培养，该液体培养基中含有的唯一氮源是尿素，A正确；B、步骤③的平板培养基是应该是以尿素作为唯一氮源的固体培养基，其目的是筛选出分解尿素的微生物，而LB固体培养基中本身就含有氮源，B错误；C、步骤③采用稀释涂布平板法接种，其目的是通过梯度稀释获得能分解尿素细菌的单菌落，C正确；D、步骤④挑取③中菌落分别接种，可通过溶液pH的变化比较细菌分解尿素的能力，尿素在分解过程中会产生氨和二氧化碳，进而会导致培养基中pH发生变化，D正确。故选B。11．尿素含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥，进入土壤能被某类细菌分解。研究人员拟从土壤中分离该类细菌并大量培养，操作流程如下图。下列相关叙述正确的是（

）A．不同的微生物均选104、105、106倍的土壤稀释液进行平板培养B．为了确保结果准确，对每个平板的菌落都要计数并取平均值C．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可以初步鉴定尿素分解菌D．④每次划线前都需要灼烧接种环，其目的都是防止杂菌污染【答案】C【分析】培养基选择分解尿素的微生物的原理：只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，故选择应以尿素作为唯一氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。【详解】A、由于土壤中细菌比真菌多，在测定土壤中细菌数量时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养，A错误；B、对微生物进行分离、计数常用的接种方法是稀释涂布平板法，估算每毫升样品中的细菌数时，往往选取30～300的平板进行计数，B错误；C、要分离获得分解尿素的细菌，培养基应以尿素为唯一氮源，在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，可初步鉴定尿素分解菌，C正确；D、每次划线前均需灼烧接种环，其中第一次划线前的灼烧是为了杀死接种环上的杂菌，之后划线前的灼烧都是为了杀死上次划线残留的菌种，D错误。故选C。12．某生物兴趣小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验，具体操作流程如图所示。下列相关叙述错误的是（

）A．振荡的目的是增加尿素分解菌的浓度B．纯化培养阶段使用选择培养基，应以尿素为唯一氮源C．中间试管涂布的3个平板的菌落平均数大于160个D．由图中数据可知土样中的菌株数约为个【答案】A【分析】每克样品中的菌株数=（c÷V）×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。【详解】A、振荡的目的是提高培养液中溶解氧的含量，使营养物质充分接触微生物，提高营养物质的利用率，其目的并不是增加尿素分解菌的浓度，A错误；B、只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，该实验的目的是对土壤中分解尿素的细菌进行分离和计数，故应选用尿素为唯一氮源的选择培养基，B正确；C、由图观察可知，用于计数的试管稀释倍数大于中间试管的稀释倍数，据此推测，中间试管涂布的3个平板的菌落平均数大于160个，C正确；D、平均菌落数为160个，该过程中稀释的倍数为，为，取进行涂布操作，因此由图示菌落计数结果可知10克土样中的菌株数约为个，D正确。故选A。13．幽门螺杆菌是一种致病菌（该菌对万古霉素、两性霉素B等抗生素不敏感，对青霉素高度敏感），其危害主要是引起胃黏膜的炎症，形成急慢性胃炎及消化道溃疡。体检时可通过14C尿素呼气实验来检测幽门螺杆菌感染情况。受试者口服14C标记的尿素胶囊后，定时收集受试者呼出的气体并测定其中是否含有14CO2以及量的多少，作为诊断指标。请回答下列问题：(1)幽门螺杆菌能够以14C标记的尿素为氮源，是因为其能产生，若要将提取的幽门螺杆菌进行扩大培养，配制培养基将仅允许幽门螺杆菌生长，同时抑制其他微生物生长，因此，该培养基又称为培养基。(2)医生为准确测定患者胃内的幽门螺杆菌数量，采取下列图示方法进行计数，此方法常用到的接种工具是，已知步骤④获得的三个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。则1ml胃液提取物中平均幽门螺杆菌数量约为个，该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，其原因是。(3)经测定患者胃液中的幽门螺杆菌呈阳性，医生提供的治疗方案是患者需连续服用（填抗生素名称）两周至14C检测呈阴性后停药。研究表明，幽门螺杆菌可以通过消化道传染，为避免传染给他人，医生还建议患者就餐时。【答案】(1)脲酶选择(2)涂布器9.5×106当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落(3)青霉素使用公筷【分析】培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。【详解】（1）幽门螺杆菌能够以尿素为氮源，是因为其能产生脲酶，脲酶能够将尿素分解为氨；选择培养基是指能够抑制其它微生物生长，同时保证所需微生物生长，故配制培养基将仅允许幽门螺杆菌生长，同时抑制其他微生物生长，因此，该培养基又称为选择培养基。（2）据图可知，图中的菌落在平板上分布均匀，接种方法是稀释涂布平板法，接种工具是涂布器；分析题意，对照组平板为0，说明培养基灭菌彻底，且微生物计数时应选择菌落在30－300之间的菌落进行计数，图示过程稀释了104倍，则1ml胃液提取物中平均幽门螺杆菌数量约为（90+95+100）÷3÷0.1×104=9.5×106个；由于个别菌落可能是由两个或多个细菌形成的，在平板上观察计数时只是一个菌落，所以运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小。（3）幽门螺杆菌属于原核生物，能被青霉素杀死，故，医生提供的治疗方案是患者需连续服用青霉素两周至14C检测呈阴性后停药；研究表明，幽门螺杆菌可以通过消化道传染，为避免传染给他人，医生还建议患者就餐时应注意用公筷等。14．人体每天产生的尿酸有2/3通过肾排出，其余1/3则通过肠道排泄，其中肠道菌群对尿酸的代谢起着重要作用。利用肠道细菌降解尿酸可为高尿酸血症的治疗提供新思路。回答下列问题。(1)研究人员需要从（填“高”或“低”）尿酸人群的粪便中采集标本，制备成菌液保存。要测定菌液中细菌的数目，可在显微镜下用计数板直接计数；除此之外还可以采用，该方法的测量值与实际值相比一般会偏小。(2)本实验用到的尿酸选择培养基需要进行（填灭菌方式）处理；培养皿需要进行（填灭菌方式）处理。(3)高效尿酸降解菌的驯化过程采用浓度梯度法把菌液分别接种于不同浓度尿酸（1.7mmol/L，1.9mmol/L、2.1mmol/L，2.3mmol/L）选择培养液中，每组3个平行样本，厌氧条件下37℃，220r/min摇床培养48h。每组3个平行样本的目的是；在厌氧条件下培养的原因是。(4)通过驯化筛选获得1株肠道细菌，命名为S3A，其在不同尿酸浓度驯化培养基中均可生长且尿酸降解率如下表，通过分析可得到的结论是。培养基初始尿酸浓度/（mmol·L1）降解后培养基尿酸浓度/（mmol·L1）尿酸降解率/%1.74±0.061.18±0.0432.21.89±0.041.19±0.0337.02.05±0.091.20±0.0641.52.26±0.081.13±0.0450.0【答案】(1)低细菌或血细胞稀释涂布平板法(2)高压蒸汽灭菌干热灭菌（或高压蒸汽灭菌）(3)依据平行重复原则，排除偶然因素对实验结果的干扰该菌为肠道菌群，代谢类型为异养厌氧型，需要提供无氧条件(4)培养基中尿酸浓度越高，S3A菌的尿酸降解率越