RNA干扰载体的构建的实验流程样本

RNA干扰载体构建实验流程RNA干扰载体重要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因构造功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA干扰实验一方面是构建RNA干扰载体，本文以pRI系列载体为例阐述了干扰载体构建实验流程。

产品技术背景

pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子专用于哺乳动物细胞RNA干扰载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子小分子RNA。由于H1启动子有精准转录起始位点和终结信号，H1启动子转录产物精准生成人工设计shRNA，shRNA通过RISC剪切后形成有2个U突出末端成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段产生，将载体转染细胞后对其他基因影响降到最低。pRI系列载体已经成功用于各种哺乳动物细胞进行基因RNA干扰。本系列中具有新霉素抗性基因载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后细胞功能和生理现象进行观测和分析。插入寡核苷酸设计pRI系列载体使用需要将人工设计寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定酶切位点之间，寡核苷酸片段中包括了针对目的基因mRNA设计长度为19nt干扰片段。合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游对的位置上。连接后载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。1.

选取干扰序列

在RNA干扰实验中，RNA干扰序列选取会明显影响RNA干扰效果。咱们建议您按照如下几点指引原则选取RNA干扰序列：推荐长度为19nt，采用21nt序列也可以获得良好效果。RNA干扰序列中不包括不不大于3nt持续相似碱基。RNA干扰序列GC含量为低到中档水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。不要将RNA干扰序列设计在已知RNA-蛋白质结合位置附近。保证RNA干扰序列与其他基因没有较高同源性。方向：在编码mRNA正义链上选取RNA干扰序列。设计RNA干扰序列是RNAi实验核心。这里提供设计原则可觉得您设计RNA干扰序列提供协助。但是，值得注意是，遵循这些原则不能保证设计RNA干扰序列对目的基因有好抑制效果。针对一种目的基因，咱们建议您至少设计3条干扰序列并且从中筛选出干扰效果好序列。2.

寡核苷酸设计。（1）设计正义寡核苷酸链(5’-3’方向)。a)5’TCGACCCb)19nt干扰序列正向序列(与目的mRNA一致)。c)TTCAAGAGA(环状构造)。d)19nt干扰序列反向互补序列。e)TTTTT。（2）设计反义寡核苷酸链(5’-3’方向)。a)去掉正义链寡核苷酸中5’TCGAb)将环节a)中得到序列做反向互补。c)在环节b)中得到序列5’端加上碱基GATC。一种设计好例子见下图：实验流程概述：如下为使用pRI载体办法概述。1.

将合成正义和反义寡核苷酸链退火。2.

用BglII和XhoI双酶切载体。3.

将退火寡核苷酸链与酶切后线性载体连接。4.

连接产物转化大肠杆菌。5.

转染细胞。6.

观测荧光表达(具有GFP载体)或筛选稳定表达细胞(具有抗性载体)。7.

检测目的基因蛋白或mRNA表达水平载体构建对于实验中诸多环节，您可以使用您实验室中惯用办法，或者您实验经验证明有效办法。对于酶切、DNA纯化以及转化等环节，您可以参照《分子克隆实验指南》进行，也可以参照您购买试剂盒中生产商提供使用阐明进行。环节1：退火寡核苷酸链依照咱们经验，脱盐纯化寡核苷酸足以满足连接和克隆需要。但是不同供应商提供引物纯度差别很大，如果您连接和克隆遇到困难，可以考虑换用PAGE纯化或HPLC纯化引物，或者使用其她供应商提供引物。用水将寡核苷酸稀释为100μM。按如下体系配制退火反映体系：正义寡核苷酸(100μM)5μl反义寡核苷酸(100μM)5μlNaCl100mMTris-ClpH7.450mM加水补足50μl将配制好退火反映缓冲液重复混合，短暂离心后放置PCR以上，运营如下程序：90℃4min，70℃10min，55℃10min，40℃10min，25℃10min。退火后寡核苷酸可以立即使用或者在-20℃长期保存。环节2：酶切载体用XhoI和BglII双酶切2μg载体。酶切办法和体系参照您购买内切酶阐明书或者按照您实验室习惯办法进行。普通状况下用大概20-30单位酶在大概3小时可以酶切完全。酶切后咱们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后载体体积稀释为30μl。对线性化载体进行去磷酸化解决是没有必要。充分酶切后载体具备不匹配末端，普通不会发生载体自连。环节3：连接载体用水将退火后寡核苷酸稀释100倍备用。按照如下体系配制连接反映体系：T4DNA连接酶5U线性化载体2μl稀释后寡核苷酸2μl10×连接酶Buffer1μl加水补足10μl接连反映条件和时间参照您购买连接酶阐明书进行。为了减少空载体自连，连接反映完毕后，在连接反映体系中加入1μlBglII，37℃反映30min，切割连接上空载体。(选做)环节4：转化大肠杆菌感受态用连接后产物转化大肠杆菌感受态细胞。市场上常用大肠杆菌感受态细胞(例如Top10，DH5-α)均可以使用，您也可以按照分子克隆中办法自己制备感受态细胞。转化办法按照供应商阐明书或者您实验室中惯用办法进行。在氨苄抗性琼脂平板上37℃培养转化后细菌，大概14-16小时后，平板上浮现单个细菌菌落。挑取各种菌落至氨苄抗性培养基中培养后进行鉴定。鉴定办法可以采用PCR鉴定或酶切鉴定。PCR鉴定采用引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和M13R-48(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)进行鉴定，空载体扩增产物长度为308bp，阳性克隆扩增产物为361bp。酶切鉴定采用HindIII和EcoRI双酶切。空载体酶切产物长度为235bp，阳性克隆酶切产物长度为288bp。鉴定对的克隆可以用引物M13R-48测序验证插入寡核苷酸序列与否对的无误。环节5：转染细胞pRI系列载体可用惯用转染办法进行细胞转染。涉及：磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染等。您可以购买市售商品化转染试剂并且参照供应商阐明书进行细胞转染实验。环节6：观测GFP荧光和稳定表达细胞系筛选如果细胞转染成功，并且您使用了带GFP载体，依照细胞生长速度不同，在转染后3-5天能在荧光显微镜下观测到细胞发出绿色荧光。请注意，绿色荧光蛋白表达表白转染细胞成功，不能阐明RNA干扰实验成功。如果您使用了带有真核抗性标签如Neo-R载体，这时您可以加入适当浓度相应药物如G418进行稳定表达细胞株筛选。环节7：检测RNA干扰效率您可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。普通状况下蛋白表达变化与mRNA水平表达变化一致，也有少数状况下mRNA表达水平变化不及蛋白表达下降明显。为检测蛋白表达状况，您可以使用Western-Blot。为检测mRNA表达状况，您可以使用逆转录+RealtimePCR或Northe