蛋白质分离纯化及鉴定

生物化学重庆医药高等专科学校佘玉罕蛋白质分离纯化及鉴定

一、蛋白质分离纯化的一般步骤1.蛋白质样品的前处理2.蛋白质粗提液的粗分级分离3.浓缩蛋白质的细分级分离4.蛋白质的结晶二、蛋白质的分离纯化方法主要是根据蛋白质在溶液中的性质不同对蛋白质进行分离。分子大小溶解度电荷吸附性质对配体分子的生物学亲和力（一）透析和超滤透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质。原理：透析流程透析装置透析样品透析袋上部空间透析液透析袋搅拌子磁力搅拌器换过几次透析液后透析液蛋白分子小分子半透明透析袋透析袋内透析袋外超过滤装置使用压力或者离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜（半透膜），达到浓缩蛋白质溶液的目的。

装好具备密度梯度的介质溶液

离心

收集分离后的各组分

加入：混和蛋白质样品离心装置（二）密度梯度（区带）离心（三）盐溶和盐析盐溶(salting-in)：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为蛋白质的盐溶现象。同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响比单价中性盐大的多。盐析(salting-out)：当溶液中的离子强度达到一定的数值时(盐浓度高达一定数值)，蛋白质的溶解度开始下降，很多蛋白质从水溶液中析出，这种现象称为盐析。（四）有机溶剂分级分离法与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。这种沉淀的主要原因是有机溶剂的加入改变了介质的介电常数。（五）电泳由于蛋白质在指定的pH溶液中所带电荷和分子量不同，形状不同，在电场中泳动速度不同。因此根据这一原理就可以从蛋白质混合液中将各种蛋白质分离开来，所以电泳技术已成为分析、分离蛋白质的重要手段之一。电泳：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE电泳)它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板(不连续体系)。凝胶的浓度(孔径大小)、缓冲液组分和离子强度、pH以及电场强度都不同浓缩胶分离胶样品浓缩成很薄的起始区带(0.1mm)分离成单区带2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS:是用SDS(十二烷基硫酸钠)和还原剂(通常为巯基乙醇)先对待分离的蛋白质样品进行预处理(加热煮沸3－5分钟)。通过加热和SDS可以使蛋白质变性：多亚基的蛋白质解离为单亚基，二硫键被切断。SDS是带有负电荷的分子，所有结合SDS的蛋白质的形状近似于长的椭圆棒，全部带上了大量的负电荷。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响(全部由负极向正极移动)，而主要取决于蛋白质分子量。(SDS)浓缩胶分离胶样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置点样浓缩胶分离胶样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置3、毛细管电泳①泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳和毛细管电泳。②用途：分离多种生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段（例如合成的寡核苷酸）和核酸以及多种小分子，如药物、甚至金属离子。用样量5～30μl1mg/ml溶液。4、等电聚焦电泳等电聚焦或称电聚焦，是一种高分辨率的蛋白质分离技术，它也可用于蛋白质等电点的测定。蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质(如浓蔗糖溶液)中进行电泳的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。等电聚焦可以把人的血清分成40多个条带。此技术特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的pI有0.02(甚至<0.02)pH单位的差别就能分开。实际上是利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质。等电聚焦电泳装置当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI

相一致的pH处，具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，达到分离的目的。胶中掺入两性电解质溶液预电泳加样电泳pH9电场作用下胶中建立了稳定的pH梯度3加入蛋白样品染色后蛋白按pH梯度分布5、蛋白质的双向电泳将等电聚焦电泳与SDS结合起来的电泳技术。电泳方向电泳方向等电聚焦电泳SDS第一向等电聚焦（IFE)第二向SDSpI降低第一向电泳后胶横向放在第二向胶上第二向胶pI降低双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。双向电泳结果（凝胶经CBB染色）pI降低分子量减小填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。支持介质：

对蛋白质交换容量大阳离子交换剂阴离子交换剂CM—纤维素(弱酸型)P纤维素(中强酸型)SE纤维素(强酸型)SPSephadex(强酸型)AM—纤维素(弱碱型)PAB--纤维素(弱碱型)DEAE-纤维素(中强碱型)DEAE-Sephadex(中强碱型)TEAE-纤维素(强碱型)QAESephadex(强碱型)（六）离子交换层析以阳离子交换型树脂为例将带有耐酸性非常强的磺酸根SO3-Na＋（以盐的形式出现）的强阳离子交换树脂（固定相）填充到层析柱中。将含有样品的流动相加入层析柱中，样品中带有正电荷的蛋白质X，通过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，结果X与Na＋交换（阳离子交换），形成SO3-X，蛋白质就结合到了层析柱上。在样品与树脂充分交换后，可通过提高流动相中的盐浓度，或改变流动相的pH，或是同时采用这两种方法，就可以将结合于树脂上的蛋白质