SN-T4849-5-2017出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法 实时荧光PCR法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法第5部分：蔓越莓和蓝莓国家质量监督检验检疫总局ISN/T4849《出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法》系列标准共分为6部分：——第1部分：蓝莓；——第2部分：树莓；——第3部分：黑加仑；——第4部分：桑葚；——第5部分：蔓越莓和蓝莓；——第6部分：猕猴桃。本部分为SN/T4849的第5部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。1出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法第5部分：蔓越莓和蓝莓1范围SN/T4849的本部分规定了出口食品及饮料中蔓越莓和蓝莓成分的检测方法实时荧光PCR法。莓为原辅料的食品及饮料中蔓越莓和蓝莓成分的定性检测(清汁及果酒除外)。本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为1%(体积比)。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T27658—2011蓝莓3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成。小浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果。分为大果红莓苔子(美洲蔓越橘)(Vacciniummac-rocarpon),小果红莓苔子(毛蒿豆)(Vacciniummicrocarpum),红莓苔子(北方蔓越橘)(Vacciniumoxycoccus),红果扁枝越橘(南方蔓越橘)(Vacciniumerythrocarpum)4个品种群。2ifolium×Vacciniumc下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)。PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)。Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonuleosidetriphosphate)。dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate)。dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate)。dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate)。dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate)。UNG:尿嘧啶N-糖基化酶(uracilN-glycosylase)。CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide)。Tris:三羟甲基氨基甲烷[Tris(Hydroxymethyl)aminomethane]。EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)。Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus)。OD:光度密度(opticaldensity)。4方法提要取DNA。以蔓越莓或蓝莓果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。使用特异性引物进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在蔓越莓或蓝莓成分。5试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1检测用引物和探针：蔓越莓和蓝莓成分扩增引物和探针、内参照(显花植物NADH基因)引物和探针详见表1。蔓越莓和蓝莓扩增靶标序列参见附录A。表1蔓越莓和蓝莓序列引物探针物种名称引物/探针序列(5'→3')扩增片段长度靶基因内参照F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACANADHdehydrogenasesubunitB(ndhB)geneR:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCAP:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1蔓越莓和蓝莓F:CATTTTAGCTTCAAATGGTTCGTCTmaturaseK(matK)R:TGAGTCCGTACCATTGAAGGTTTTAP:FAM-ACGCTTGAAAGATAGCCCAGAAAGTCGAA-TAMAR35.4CTAB提取缓冲液：20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNa₂EDTA,5.670%乙醇(体积分数)。5.8蛋白酶K(20mg/mL)。5.9实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U～2U(Unit,酶学单位)的Taq酶、1×TPs、0.2mmol/L～0.4mmol/LdUTP,400nmol/LROX染料。6仪器设备6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3恒温水浴锅。果汁样品取适量15000r/min离心30min,取沉淀部分。取50mg～500mg样品，加入1mLCTAB提取缓冲液，同时加入0.01倍体积的20mg/mL蛋白酶K,65℃温育1h～2h,期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量CTAB提取缓冲液；取出后12000r/min离心10min,转移上清至2mL离心管中，加入0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，12000r/min转速下离心10min;转移上清至另一灭菌的离心管中，再加入0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心10min;转移上清至干净离心管中，加入等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h;13000r/min的转速离心10min;弃上清，加入350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀；加入0.8倍体积的异丙醇或2倍体积—20℃冰箱中预冷的无水乙醇混匀，-20℃放置30min,12000r/min4℃离心10min,弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min,弃上清，室温下晾干。加入50μL～100μL双蒸水，室温10min,混匀，4上述模板DNA均可用等效DNA提取试剂盒提取。7.3DNA浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值Az₀和A₂s。DNA的浓度按照式(1)计算：c=A×N×50/1000 式中：c——DNA浓度，单位为微克每微升(pg/μL);A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。当A₂o/Aza₀比值在1.7～2.0之间时，适宜于PCR扩增。7.4.1每个试样PCR反应应设置3次重复。表2实时荧光PCR反应体系试剂体积实时荧光PCR反应混合液正向引物(10μmol/L)DNA模板(5ng/μL～100ng/μL)灭菌ddH₂O7.4.3实时荧光PCR反应程序按如下条件进行：a)内参照基因：50℃2min;95℃预变性10min;95℃15s,60℃1min,40个循环。b)蔓越莓和蓝莓matk基因：50℃2min;95℃预变性10min;95℃15s,60℃1min,45个循环。7.5对照反应7.5.1所有试样均应同时设置平行的内参照检测与蔓越莓和蓝莓特异性检测，各体系中除引物探针外，其余组分及反应条件均与7.4一致。7.5.2在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照，各对照反应体系中，除模板外，其余组分及反应条件应与7.4一致。8质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>45.0。5b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>45.0。c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值≤30.0。9结果判断与表述9.1结果判定在符合第8章的情况下，结果判定如下：a)Ct值≤40,则判定为阳性。b)40<Ct值<45,则重复实验一次。再次扩增后，Ct值<45,应查看相应的扩增曲线并结合荧光信号判定结果；Ct值≥45,则判定为阴性。c)Ct值≥45,则判定为阴性。9.2结果表述10检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。6CATTTTAGCTTCAAATGGTTCGTCTCTTTTGATGAATAAATGGAAATATTACCTTGTCAATTTCTGGGAATGTTATTTTTCCATATGGGCTCAACCAAGAAGGATCCATATAAACCAATTATCCAATAATTCCTTCGACTTTCTGGGCTATCTTTCAAGCGTACGATTA