SN-T 2627-2010马铃薯卷叶病毒检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准马铃薯卷叶病毒检疫鉴定方法2010-05-27发布国家质量监督检验检疫总局I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、四川省农业厅植物检疫站、四川农业大学。1马铃薯卷叶病毒检疫鉴定方法本标准规定了进境植物检疫中马铃薯卷叶病毒检测鉴定的程序。本标准适用于马铃薯块茎、种苗等茄科植物感染马铃薯卷叶病毒的检验和鉴定。2原理马铃薯卷叶病毒(potatoleafb)lvirus,PLRV)属马铃薯黄症病毒科，马铃薯卷叶病毒属。病毒粒体球状，粒体直径23nm～25nm,是等轴对称病毒，致死温度7O℃,稀释限点约10-*。引起马铃薯卷叶病毒病。马铃薯病毒病一般根据病害症状很难确定病事种类，采用免疫学和分子生物学方法，可快速根据有关判断标准进行马铃幕卷叶病毒检疫鉴定。3试剂与材料除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。3.1免疫学检验试剂3.1.1捕捉抗体(Capture储藏于4℃条件下备用。3.1.2酶标抗体(Alkalineantibob)马钱薯卷phofphataseJnzynfe病毒免疫球蛋白抗体稀释度按市售产品要求进行。conjugdte):国碱性磷酸酶标记的马铃薯卷叶病毒的免疫球蛋白抗体。按市售产品要求进行稀释，储段于4个条件下备用。3.1.3包被缓冲液(Coatingbbffer):取2.9kg碳酸氢钠(NHCO,)、1.59g碳酸钠(Na₂CO₃)、0.2g叠氮化钠(NaN₂),用1000ml装馏水浴解，并调pl值到P.6,储以手4℃条件下备用。3.1.4洗涤液(PBSTBuffer);取1.15g无水磷酸点二钠(Na₄HP()、0.2g氯化钾(KCl)、0.2g无水磷酸二氢钾(KH₂PO₄),8.0g氟化钠(NaC1)、0.5B吐温-,用1300ml.蒸馏水溶解，并调整pH值到3.1.5样品提取液(GEBbuffer):取1.3g无水硫酸钠(Na₂SO₄)、20.0g聚乙烯吡咯烷酮[(C₆H₉NO)z₄~4%]、0.2g叠氮化钠(NaN₃)、2.0gⅡ级鸡蛋清白蛋白粉、20.0g吐温-20,用1000mL洗涤液溶解，并调整pH值到7.4,储藏于4℃条件下备用。3.1.6酶标抗体稀释缓冲液(ECIBuffer):取0.2g牛血消白蛋白(或脱脂奶粉)、2.0g聚乙烯吡咯烷酮[(C₆H₉NO).]、0.02g叠氮化钠(NaN₃),用100mL洗涤缓冲液溶解，并调整pH值到7.4,储藏于3.1.7底物缓冲液(PNPBuffer):用80mL灭菌蒸馏水将0.01g氟化镁(MgCl₂)、0.02g叠氮化钠(NaN₃)、9.7mL二己醇胺(CH₂CH₂OH)溶解后，用盐酸调pH值到9.8,定容到100mL,储藏于4℃条件下备用。3.1.8底物溶液(PNPsubstate):将5mg对硝基苯磷酸盐(C₆HsNO₃)溶解于5mL底物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前15min内，避光条件下制备。3.1.9终止液：12g氢氧化钠(NaOH)溶于100mL蒸馏水。23.2RT-PCR检验试剂3.2.1莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(MMLV):100U/pL。3.2.21×TAE缓冲液：40mmoi/LTris-HCl,20mmol/L乙酸钠，2mmol/LEDTA(用冰乙酸调pH至8.0)。3.2.35×RT缓冲液(5×RTBuffer):50mmol/LTis-HClpH7.5,100mmol/L氯化钠，0.1mmol/LEDTA,10mmol/LDTT,0.01%NP-40,50%甘油。3.2.410×PCR缓冲液：100mmol/LTris-HCl(pH8.3),500mmol/L氯化钾。3.2.6RNA酶抑制剂(RNasin):10U/μL。3.2.7RT增强剂(RTEhancer)。3.2.8无水乙醇(CH₃CH₂OH)。3.2.9RL裂解液。3.2.10去蛋白液。3.2.12dNTPMixture10mmol/L。3.2.13漂洗液。3.2.14双蒸水(ddH₂O)。3.2.152-巯基乙醇(MCE)C₂H₆OS。3.2.16液氮(N₂)。3.2.17引物：上游引物(P1)碱基序列：5’-AGGCGCGCTAACAGAGTTCA-3’,下游引物(P2)列：5’-CTTGAATGCCGGACAGTCTG-3’,用双蒸水稀释至20μmol/L。3.2.19溴酚蓝(CgH₁₀Br₄O₃S)。3.2.20琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖缓缓倒人250mL三角瓶内，加入100mL1×TAE,在微波炉中加热1min溶解后，再加入5μLGoldview的生物染料，倒入调平并安放适当梳齿的制胶板上，冷凝后小心拔出梳齿。4仪器及用具4.1聚乙烯微量滴定板：根据样品数量选用40孔和96孔两种规格。5ml五种规格及配套吸头。4.3天平1/100g,1/1000g。4.4培养箱。4.5台式高速离心机。4.6酶联免疫检测仪。4.7水平电泳仪。4.8凝胶成像系统。4.9PCR扩增仪。4.11研钵：内径60mm～80mm。4.12剪刀。34.15涡旋混匀器。5检测与鉴定送实验室作进一步鉴定。6实验室检验检验方法见附录A。如采用认可的试剂盒，按说明操作。样品的制备与检验方法见附录B。如采用认可的试剂盒，按说明操作。在阴性对照OD值≤0.1,且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带PLRV;否则判定为阴性反应，即样品不带PLRV。在阴性对照无扩增条带，且阳性对照出现222bp目标条带的前提下，样品RT-PCR产物电泳结果8样品保存经检疫鉴定后的样品，应在一80℃~-20℃保存3个月，以备复验、谈判和仲裁，保存期满后，需进行灭活处理。4SN/T2627—2010(规范性附录)马铃薯卷叶病毒DAS-ELISA检验程序A.1包被抗体向酶联反应板每孔加入100μF用包被缓中液稀种的捕捉抗体，将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育4h或4℃冰箱过夜。A.1.2洗板向每个反应孔中加人200μL洗涤液，迅速倒出，重复2次，流板完成后将酶联板倒置于吸水纸上吸干反应孔中残留液体。A.2点样A.2.1样品制备品提取液究穷研磨后，再加入2mL样品提取液嗣样间临注意防止样品的交叉污染。将待测样品剪碎，取0.3品提取液究穷研磨后，再加入2mL样品提取液嗣样间临注意防止样品的交叉污染。充分研磨至均匀。剩余样品于-20℃冰第保存备查，A.2.2点样用微量进样器将制备好的样是加入是联反屋板孔内，每个样品3饮重复，每孔100μL。设置阳性对照、马铃薯健康组织研磨液阴性时照和包被缓中液空由对照。加样完成后将酶联反应板置于保湿容h或4℃冰箱h。A.2.3洗板在每个反应孔加满洗涤液，迅建倒出再加满洗淡液，静置3min后将洗涤液迅速倒出。重复3次。洗板完成后将酶联板倒置于吸水纸，吸杆反应孔中残留液体。A.3结合酶标抗体A.3.1加酶标抗体向酶联反应板每孔加入100μL用酶标抗体稀释缓冲液按比例稀释的酶标抗体溶液。置于保湿容器中室温孵育2h。A.3.2洗板A.4显色每孔加入100μl.底物溶液。25℃避光孵育30min～60min,至阳性对照显色。5A.5终止反应A.6结果测定和记录用酶联检测仪测定并记录光密度值(OD值)。6(规范性附录)马铃薯卷叶病毒的RT-PCR检验程序采用TIANGENRNAprepPlantKit试剂盒”提取马铃薯卷叶病毒RNA。称取50mg～100mg的马铃薯叶片或茎秆(薯块需经发芽后切取幼芽),在液氮中迅速研磨成粉末状，转移粉末至预冷的1.5mL的EP管中，加入500μL的RL裂解液(使用前按RL裂解液1mL,加入2-巯基乙醇10μL),涡旋剧烈振荡5min使其混匀。将匀浆液转移至CS过滤柱上，12000r/min离心2min～5min,小心吸取上清液至无RNA酶(RNase-free)的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。缓慢加入上清0.5倍体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入CR吸附柱中，12000r/min离心1min,离心1min,弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入500μL漂洗液RW,12000r/min离心1min,弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复漂洗一次。漂洗完后，将吸附柱在12000r/min离心2min,去除残余液体，并在室温下放置片刻。将吸附柱放入一个新的RNase-free离心管中，向膜中央加人50μL～100μL无RNA酶的双蒸水，室温放置2min,12000r/min离心2min,得到RNA溶液。B.2RT-PCR扩增B.2.1反转录B.2.1.1反应体系RT反应体系见表B.1。表B.1马铃薯卷叶病毒RT反应体系反应物模板MMLV加人量/μL41B.2.1.2程序B.2.2PCR反应B.2.2.1反应体系PCR反应体系见表B.2。SN/T2627—2010表B.2PCR反应体系反应物聚合酶氯化镁加入量/μl.114B.2.2.2反应程序反应程序为：94℃3