兽医病毒学课件

病毒学概述病毒与病毒学病毒学的发展历程研究病毒学的意义

（一）病毒(virus)

概念：形体微小，结构简单，仅含有1种核酸DNA或RNA，具有超级寄生性，且必须在电子显微镜下才能观察到的一类非细胞形态的微生物。一、病毒与病毒学

病毒与其它微生物的区别

特性病毒细菌支原体立克次体衣原体真菌通过细菌滤器(0.45μm)+---+-结构非细胞原核细胞原核细胞原核细胞原核细胞真核细胞有无细胞壁-+-+++核酸类型DNA或RNADNA＋RNADNA＋RNADNA＋RNADNA＋RNADNA＋RNA在人工培养基上生长-++--+增殖方式复制二分裂二分裂二分裂二分裂有性或无性抗生素敏感性-+++++干扰素敏感性+-----病毒的重要特性

严格的寄生性离开寄主细胞便不能进行繁殖并会失活。必须有寄主的遗传信息、能量及酶系统的参与方能进行核酸复制、蛋白质合成并装配产生子代病毒。侵染性、致病性和寄主范围a.病毒只侵染活的寄主细胞,并存在病毒与寄主细胞间的相互识别机制。b.病毒在复制过程中扰乱了寄主的正常代谢,最终造成寄主发病。抗原性在哺乳动物体内可激发产生抗体

病毒生命形式的两重性

病毒存在的两重性细胞外形式（病毒颗粒）和细胞内形式（核酸分子）。病毒的结晶性与非结晶性病毒有化学结晶型和生命活动型的两种形式。颗粒形式与基因形式以颗粒形式存在于细胞外，具感染性；以基因形式增殖。

（二）病毒学研究病毒的科学叫做病毒学。病毒学是微生物学中的重要领域，是具有相当独立性的分支学科。病毒学涉及医学、兽医、环境、农业及工业等广阔领域，相应发展成医学病毒学、兽医病毒学、环境病毒学、植物病毒学及昆虫病毒学等分支学科。病毒学已成为人们认识生命本质，发展国民经济和保证人畜健康而必须深入研究的重点学科。

有关病毒学的专门刊物ActaVirologicaAntiviralResearchArchivesofVirologyIntervirologyJournalofGeneralVirologyJournalofMedicalVirologyJournalofVirologyMethodsJournalofVirologyVirologyVirusGenes中国病毒学病毒学报实验和临床病毒学杂志二、病毒学的发展历程（一）经验时期（二）病毒的发现时期（三）病毒本质的研究时期（四）现代病毒学时期公元前14世纪古埃及长老石刻象显示了小儿麻痹后遗症，这可能是病毒感染的第一个史载记录脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)与小儿麻痹症(ParalyticPoliomyelitis)（一）经验时期Smallpox(天花)中国从公元十世纪就有接种人痘预防天花的记载；1796年英国医生Jenner得出结论：牛痘可能使人预防天花，挽救了千百万人的生命。

Rabies(狂犬病)

EndemicinEuropebyAD16-17

发明了狂犬病疫苗（1885）巴斯德(LouisPasteur,1822-1895)关于植物病毒病害的记载

荷兰郁金香杂色病(1576)

欧洲马铃薯退化病(1775)

17世纪荷兰人对病毒感染郁金香植株后形成具有条斑花朵比未被感染的单色花更为诊视关于昆虫病毒病害的记载十二世纪中叶我国《农书》中，已有关于家蚕“高节”、“脚肿”等病症的记载。这就是我们现在所知家蚕核型多角体病毒。而国外直到十九世纪中叶，Cornelia和Maestri才记述了家蚕的黄疸病或多角体病的症状。（二）病毒的发现时期伊凡诺夫斯基，俄罗斯著名科学家，1892年重复了麦尔的试验，而且证明了病原的滤过性

1898年，荷兰科学家贝杰林克(Beijerinck)重复了伊万诺夫的实验，认为这种侵染性物质要比通常的细菌小。贝杰林克用“病毒(Virus)”来命名这种史无前例的小病原体。

德国人AdolfMayer1886年发现烟草花叶病，证明这种病是可以传染的，并认为可能是一种细菌病。

德国兽医微生物学家Loeffler和Frosch于1898年报道口蹄疫病毒，发现了动物和人类的第一个病毒，是微生物学发展史上的重要里程碑。

LoefflerandFrosch（三）病毒本质的研究时期1937年证明烟草花叶病毒是一种核蛋白(核酸5%;蛋白95%)

FrederickCharlesBawden(1908-1972)WendellMeredithStanley(1904-1971)1935年首次获得烟草花叶病毒结晶,称其为一种蛋白质,1946年获诺贝尔奖。

JohnEnders(1897-1985)

1949年在体外培养的细胞中获得脊髓灰质炎病毒,1954年获得诺贝尔奖。AaronKlug(1926-)

1962年提出了烟草花叶病毒病毒的柱状结构,1982年获得诺贝尔奖。DavidBaltimore(1938-)

1970年在提纯的罗斯肉瘤病毒粒子中发现了逆转录酶，证明遗传信息可以由RNA反向产生DNA。---生物学中心法则。1975年获得诺贝尔奖。（四）现代病毒学MichaelJ.Bishop(1936-）

1976年发现正常细胞中存在罗斯肉瘤病毒致瘤基因的对应基因,1989年获诺贝尔奖。PhillipA.Sharp(1944---),1977年发现腺病毒基因组中存在基因剪切现象(genesplicing),1993年获诺贝尔奖。FredSanger(1918-)

1977年建立了DNA序列分析方法,并对ΦX174噬菌体的单链DNA序列进行了测定。因此获得诺贝尔奖。Gallo&Montagnier

1983年分离到一种与爱滋病(AIDS,AcquiredImmunodeficiencySyndrome)有关的逆转录病毒。R.Beachy

1986年利用烟草花叶病毒外壳蛋白基因转化植物,获得抗TMV侵染的基因工程植株。这一研究为抗病毒动植物基因工程奠定了基础。StanleyBPrusiner(1942-)发现朊病毒(Prions)，1997年获诺贝尔奖。

（1）病毒威胁着人类文明与生命健康（2）病毒性疾病对国民经济造成严重的影响

三、研究病毒学的意义1.控制和消灭病毒性疾病2.病毒的研究和利用价值

（1）改良品种（2）培育活病毒疫苗株（3）保护生态环境（4）利用病毒作为昆虫杀虫剂（5）基因工程研究的重要载体复习思考题1.何谓病毒？病毒的特性有哪些？2.研究病毒学有何实际意义？病毒的形态结构

弄清病毒的形态结构，对开展病毒的分类、起源及应用研究具有十分重要的意义。测量病毒的单位为纳米(nm)一般病毒大小在100nm左右测量病毒大小的方法

电子显微镜、过滤一、大小微生物的大小比较葡萄球菌(1000nm）

牛痘病毒300×250nmABCDEFG立克次体450nm衣原体390nmA、大肠杆菌噬菌体

(65×95nm)B、腺病毒

(70nm)C、脊髓灰质炎病毒

(30nm)D、乙脑病毒

(40nm)E、蛋白分子

(10nm

)F、流感病毒

(100nm)G、烟草花叶病毒二、形态病毒子（virion):一个形态和结构上完整的病毒颗粒。病毒的形体及其微小，结构简单，但它们的形状却是形态各异，丰富多彩。1.病毒的个体形态多数呈球状或近似球状，少数为杆状、丝状或子弹状，细菌病毒（噬菌体）大多数呈蝌蚪状。2.病毒的群体形态包涵体噬菌斑空斑病毒粒子感染寄主细胞后，可形成大量病毒粒子和蛋白质构成的病毒群体，可用光学显微镜甚至肉眼观察到。（1）包涵体

病毒感染寄主细胞后，在细胞质或细胞核内所形成的在光学显微镜下可见的小体，多为圆形、卵圆形或不定形，称为包涵体。包涵体的本质病毒的聚集体病毒的合成部位病毒感染有关的蛋白质非病毒性包涵体（2）噬菌斑

噬菌体感染细菌后，使细菌细胞破裂死亡，连续的重复感染使大量的细菌死亡，这样，在培养细菌的平板上可以看到一个个透明不长细菌的小圆斑，这些圆斑由无数个噬菌体粒子组成的群体，称为噬菌斑。

人工培养的单层动物细胞感染病毒后，也会形成类似噬菌斑的动物病毒群体，叫做空斑。（3）空斑单层细胞空斑二、病毒的结构裸露病毒囊膜病毒病毒体结构模式图壳粒衣壳芯髓核衣壳囊膜囊膜病毒囊膜子粒核心：核酸→基因组genome→决定病毒遗传、变异和复制壳粒capsomere→衣壳capsid→保护、介导、抗原性囊膜envelope，囊膜子粒peplomere（纤突spike）→保护、介导、抗原性

病毒的结构病毒粒子核衣壳囊膜：有纤突

（基本结构）（非基本结构）芯髓衣壳（核酸）基因组：DNA/RNA，双股/单股，分段/不分段壳粒（形态亚单位）多肽（结构亚单位）三、病毒的化学组成核酸蛋白质脂质碳水化合物其他组成（一）核酸：决定病毒的遗传和变异。特点：（1）病毒只含一种核酸，构成病毒体的芯髓。（2）核酸类型多样化核酸可分单股（singlestranded）或双股（doublestranded）、线状（linear）或环状（circular）、分节段（segmented）或不分节段

mRNA的碱基序列作为标准，凡与此相同的核酸称为正股（positivesense），与其互补的则为负股（negativesense）。

核酸线状、分节段核酸双股环状（3）分子量小，基因组结构简单，所含基因组数目少。（4）病毒基因组核酸复制多样化病毒核酸能作为mRNA或者能利用宿主细胞的

RNA聚合酶转录病毒的mRNA病毒核酸不分节段（6）有些病毒去除囊膜和衣壳，裸露的DNA或RNA

也能感染细胞，这样的核酸称为感染性核酸。具备条件：（5）病毒核酸更易受宿主细胞的影响而发生基因突变和重组（二）蛋白质组成蛋白质的氨基酸及顺序决定着病毒株的差异，表现在抗原决定簇则决定其免疫特异性。病毒的蛋白质根据是否存在于病毒颗粒中分为结构蛋白和非结构蛋白。

2.结构蛋白：系指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质。包括壳体蛋白和囊膜蛋白等。

1.非结构蛋白：指由病毒基因组编码的，在病毒复制或基因表达调控过程中具有一定功能，但不结合于病毒颗粒中的蛋白质。⑴壳体蛋白

构成病毒的壳体，保护病毒的核酸。

无囊膜病毒的壳体蛋白参与病毒的吸附、进入，决定病毒的宿主嗜性，同时还是病毒的表面抗原。

是构成病毒壳体结构的蛋白质，由一条或多条多肽链折叠形成的蛋白质亚基，是构成壳体蛋白的最小单位。

功能：

⑵囊膜蛋白

是病毒的主要表面抗原，它们与细胞受体相互作用启动病毒感染发生，有些还介导病毒的进入

还可能具有凝集脊椎动物红血球细胞、细胞融合以及酶等活性

基质蛋白构成膜脂双层与核衣壳之间的亚膜结构，具有支撑囊膜、维持病毒

构成病毒囊膜结构的病毒蛋白质，包括囊膜糖蛋白和基质蛋白两类。

功能：

蛋白质功能：保护病毒核酸，使其免受核酸酶或其它理化因素的破坏参与病毒感染细胞的过程，决定病毒对宿主细胞的亲嗜性抗原性：诱导特异性抗体、致敏淋巴细胞的产生（三）脂质许多病毒囊膜内存在有脂类化合物，如磷脂、脂肪酸、甘油三酸脂和胆固醇等。这些脂类几乎都是由病毒粒子在细胞内成熟，在细胞膜处以出芽方式释放，直接从寄主细胞膜上得到。病毒脂类存在与病毒的吸附和侵入有关。

（四）碳水化合物

除病毒的核酸中所含戊糖外，有的病毒还含有少量的碳水化合物，为核糖或脱氧核糖和磷酸组成的核酸骨架。有囊膜病毒中碳水化合物以寡糖侧链的形式与蛋白质结合形成囊膜糖蛋白。

（五）其它组成

在某些动物病毒中存在多胺类有机阳离子，包括丁二胺、亚精胺、精胺等，它们大都结合于病毒核酸，对核酸的构型有一定影响。在某些病毒的病毒体中，还发现有其它的小分子量组份，如ATP，对噬菌体尾鞘收缩提供能量。

四、病毒的分类命名

国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonmyofViruses,ICTV)是国际公认的病毒分类与命名的权威机构。

1.病毒分类系统第7次分类报告在部分科基础上建立了3个目，其中1个尾病毒目（Caudovirales）涉及噬菌体，2个涉及动物病毒，分别是单负股病毒目（Mononegavirales）和套式病毒目（Nidovirirales）。分类系统:目、科（亚科）、属和种分类阶元构成。科和属是病毒分类系统的最主要单位。2.病毒的命名与书写规则病毒的命名要由公认的国际专家小组负责不采用拉丁文双名法，而是英文或英语化的拉丁文，只用单名被ICTV正式认定的病毒名，用斜体书写;一般通用名则用正体

例:减蛋综合征病毒，学名为DuckadenovirusA（鸭腺病毒甲型），兽医界通用名Eggdropsyndromevirus。目、科、属分别用拉丁文后缀“-virales”、“-viridae”及“-virus”

如Circoviridae环状病毒科

Circovirus环状病毒属复习思考题绘出病毒的结构示意图，并说明各部分名称。解释包涵体、噬菌斑、空斑的概念何谓感染性核酸？构成感染性核酸需具备哪些条件？病毒由哪些化学成分组成？病毒的分类系统及命名书写规则。亚病毒Subvirus

亚病毒（subvirus):比病毒更小、结构和化学组成更为简单，具有感染性的致病因子。

根据其生物学特性和致病特征可分为类病毒(viriod)、朊病毒（prion）和卫星因子(satellites)，其中卫星因子包括卫星病毒(satellitevirus,SV)和卫星RNA。一、类病毒

1922在美国首次发现马铃薯纺锤形块茎病1960我国首次在黑龙江省发现1967-1971Diener研究此病后报道并命名为马铃薯纺锤型块茎病类病毒感染（一）定义

类病毒是指存在于某些生物中并能引起特殊病害的，其相对分子量较低的一种小RNA分子，其核酸外无外壳蛋白，将其引入到同种的健康个体内时，能自主复制并引起特殊症状。类病毒主要使植物致病，引起马铃薯、柑橘、椰子、啤酒花等多种重要的经济植物的严重损害，但类病毒与人类疾病的关系尚未见报道。（二）特点大小仅为最小病毒的1/20由单链共价闭和环状RNA分子组成呈碱基配对的杆状结构，无蛋白衣壳对核酸酶敏感，对热、有机溶剂有抵抗力其复制依赖于宿主细胞的转录酶系统，而不需要辅助病毒的存在内环二、卫星因子(satellites)

卫星RNA卫星病毒

卫星因子是指必须依赖宿主细胞内共同感染的辅助性病毒才能复制的核酸分子或小病毒。（一）卫星病毒(satellitevirus,SV)一种病毒的增殖常常需要另一种病毒的帮助才能完成，这是由于该病毒基因组有缺陷，我们将它称为称为卫星病毒。而具有辅助作用的病毒称为辅助病毒(helpervirus)。⑴卫星病毒单独没有侵染性，必需依赖辅助病毒才能侵染和复制。⑵卫星病毒并不是辅助病毒复制所必需的，一般有抑制辅助病毒复制的作用。⑶卫星病毒的RNA能够编码自身的外壳蛋白，其外壳蛋白与辅助病毒没有血清学关系。⑷卫星病毒的RNA与辅助病毒基因组RNA的核苷酸序列无同源性。特点：（二）卫星RNA卫星RNA是指依赖于辅助病毒才能进行复制，但其本身没有编码外壳蛋白的遗传信息，而是包裹于辅助病毒的外壳蛋白之中。⑴卫星RNA单独没有侵染性，必需依赖辅助病毒才能侵染和复制。⑵卫星RNA可干扰辅助病毒的复制。⑶卫星RNA不具有编码能力，需要利用辅助病毒的外壳蛋白，并与辅助病毒基因组RNA一起包裹在同一病毒粒子内。⑷卫星RNA与辅助病毒基因组RNA的核苷酸序列无同源性。特点：三、朊病毒（Prion)定义：是一类感染人与其他哺乳类动物，仅具有传染性蛋白质，而无核酸的病原体。朊病毒对人类最大的威胁是可以导致人类和家畜患中枢神经系统退化性病变，最终不治而亡。

（一）生物学特性导致退化性脑组织病理学反应无炎症反应无干扰素产生无免疫原性免疫B细胞、T细胞的功能未变化朊病毒是机体正常的PrPc变构形成的。朊病毒蛋白（prionprotein,PrP)有两种构象：正常型PrPc和致病型PrPsc。两者的主要区别在于其空间构象上的差异。PrPc仅存在a螺旋，而PrPsc有多个β折叠存在，后者溶解度低，且抗蛋白酶解。（二）本质SecondaryStructureofaProteinorPolypeptide

（三）复制

□→□□+

→□□□□

→注：

表示PrPc，□表示PrPsc一个致病分子（PrPsc）先与一个正常分子（PrPc）结合，在致病分子的作用下，正常分子转变为致病分子，然后这两个致病分子分别与两个正常分子结合，再使后者转变为致病分子，周而复始。（四）致病性

PrPsc大量聚集，形成痒病相关纤维（SAF），在脑组织中形成空斑。致病的基本条件是必须同时具备朊病毒和朊病毒蛋白。

痒病相关纤维病理变化:

海绵状脑病。脑组织空泡变性，淀粉样蛋白斑块，神经胶质细胞增生等。人类朊病毒病

库鲁病、克雅病、新型克雅氏病等动物朊病毒病

牛海绵状脑病、羊瘙痒症、水貂脑病等所致疾病牛海绵状脑病（bovinespongiformencephalopathy,BSE）俗称“疯牛病”，表现突然发作、运动失调、性情暴躁等致病性：病变仅见于脑，神经元变性、空泡化；无炎症反应和免疫反应，无宿主特异性。

诊断：

（1）脑组织病理组织学检查（2）免疫酶组化（3）免疫转印防制：严格检疫，一经发现，坚决销毁

组织病理学免疫组化免疫转印27-30KD痒病（Scrapie)是研究其他传染性海绵状脑病的原始模型主要发生于成年绵羊，偶尔见于山羊的中枢神经系统疾病表现为剧痒、精神萎顿、肌肉震颤、运动失调等经口感染，也可经体表感染致病性、诊断和防制见BSE复习思考题名词解释：亚病毒、类病毒、卫星病毒、卫星RNA、朊病毒类病毒、卫星病毒、卫星RNA和朊病毒的主要生物学特性。如何进行疯牛病的诊断？病毒的培养动物接种鸡胚接种细胞培养一、鸡胚接种一种比较经济简便的方法。卵壳壳膜（1）保证不携带病原微生物，最好是SPF胚（2）对分离的病毒无母源抗体1.选择禽胚的标准接种日龄：同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。如尿囊腔接种多为9～11日龄，而绒毛尿囊膜接种多为10～13日龄。

接种途径：不同病毒的增殖有不同的接种途径，不应伤及胚体和血管，以免影响其发育。严格防止禽胚污染

鸡胚接种时严格无菌操作。2.接种

鸡胚绒毛尿囊膜接种法

尿囊腔接种法

鸡胚卵黄囊接种法3.鸡胚接种的优缺点：优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大，不需特殊设备

缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。

人或动物细胞在一定条件下可在实验室的培养瓶内生长。细胞培养(cellculture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进行培养。

二、细胞培养细胞培养迅速发展的原因：由于胰蛋白酶和螯合剂的应用，使组织细胞分散而不受损伤综合培养基的发展抗生素的应用绝大多数病毒都能在细胞中生长优点：每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等无个体差异，准确性和重复性好可严格执行无菌操作细胞培养本身就能显示病毒的生长特征应用空斑技术可进行病毒的克隆化根据细胞的来源、染色体特征及传代次数，可分为三种类型：（一）细胞的类型原代细胞二倍体细胞传代细胞动物组织经胰蛋白酶消化处理，使细胞分散而得到的细胞。优点：最适合病毒的分离缺点：易含潜伏病毒1.原代细胞

原代细胞培养剥离组织机械破碎细胞过滤洗涤细胞胰酶消化计数、培养2×104-4×104/mL将长成单层的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其染色体数与原代细胞一样，保持其二倍染色体数目的细胞，称为二倍体细胞。优点：细胞碎片少，细胞均匀，潜伏病毒易发现，对病毒的敏感性与原代细胞相似，而且容易得到。2.二倍体细胞能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而成。优点：容易培养，生长迅速，随时可获得缺点：对病毒分离不太敏感，不能用来制备疫苗3.传代细胞细胞的传代培养细胞单层细胞分散分瓶培养

胰酶消化细胞的冻存细胞单层细胞沉淀细胞冻存细胞分装调细胞浓度1×106-1×107mL

胰酶消化4℃2h；-70℃15h；液氮冻存液：含20%FCS、10%DMSO的营养液细胞的复苏冻存细胞速溶换液

37℃培养移入细胞瓶

37℃水浴加含20%FCS营养液4h后培养至单层

静置培养(stationaryculture)旋转培养(rollerculture)悬浮培养(suspensiveculture)微载体培养(micro-carrierculture)（二）细胞培养方法静置培养：实验室常用。细胞悬液装瓶，5%CO2温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。2.旋转培养：大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转（5-10r/min)，细胞帖附于玻瓶四周，长成单层。3.悬浮培养

通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。4.微载体培养是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。

微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收培养液和化学反应，细胞可贴附其上长成单层。由于微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述常规方法大为增加，对规模化的细胞或疫苗生产很有吸引力，但增高了生产成本。微载体有若干型号，已商品化。

培养液：RPMI-1640、199、DMEM等

血清细胞接种量pH：细胞生长的pH值为6.6～7.8，最适7.0～7.4温度：最适温度与细胞来源的动物体温一致无菌条件培养器皿清洁度（三）细胞培养要素血清成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。血清使用：目前国内多用犊牛血清，使用前须经56℃灭活30min，并进行细胞毒性试验。生长液血清含量一般为5％～20％。维持液中血清量为0%～5％。细胞接种量细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少，这些物质分泌量少，而作用也小。接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多对细胞生长也不利。一般为10万-

100万／m11细菌污染：营养液很快混浊，细胞死亡脱落2真菌污染：培养液中可见黄白色小点状悬浮物，镜检时可见菌丝结构。

3支原体污染：最常见，污染率为50％～60％4病毒污染：①组织带毒②培养液带毒（四）细胞培养污染问题1血清：维持液内犊牛血清含量一般不超过2％。2温度：多数37℃。3pH：一般在7.6～7.84病毒接种剂量：一般按维持液的1～10％(V／V)量接入。接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价；接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。

5病毒接种方法：异步接毒和同步接毒。（五）细胞培养病毒要素（六）病毒增殖指标与收获1.细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)由病毒感染导致的细胞损伤。CPE能在光学显微镜下观察。①细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等；②细胞聚合，如腺病毒；③细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；④有些病毒能形成包涵体。正常细胞CPE2.病毒收获CPE达80％时收获，反复冻融多次使病毒释放，然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20℃保存。测定病毒感染力的方法半数致死量LD50(50%lethaldose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(50%egginfectivedose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50%tissuecultureinfectivedose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）：用细胞来检测50%组织细胞感染量（TCID50）能够使半数组织细胞在一定条件下发生细胞病变的病毒量。用于判定病毒的毒力。TCID50测定单层细胞接种病毒37℃培养观察CPE系列稀释的病毒液10-1

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1.Reed法lgTCID50

=CPE>50%稀释度对数+距离比例×稀释倍比数对数距离比例

=CPE>50%百分数-50%CPE>50%百分数-CPE<50%百分数2.Karbar法

lgTCID50

=l+d(s–0.5)l：病毒最低稀释度的对数d：稀释倍比数的对数s：出现CPE的比率之和10-1

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例子：

Reed法计算稀释度CPE孔数无CPE孔数

累计CPE孔数无CPE孔数出现CPE孔比例10-180220100(22/22)10-280140100(14/14)10-3

536366.7(6/9)10-4

171109.1(1/11)10-5080180(0/18)lgTCID50

=CPE>50%稀释度对数+距离比例×稀释倍比数对数

=-3+0.29×(-1)

=-3.29距离比例

=CPE>50%百分数-50%CPE>50%百分数-CPE<50%百分数=（66.7%-50%)/(66.7%-9.1%)=0.29TCID50

=10-3.29,0.1mL含义：该病毒稀释至10-3.29,每孔细胞接种0.1mL，半数细胞孔出现CPE。病毒毒价:通常以每mL含多少TCID50表示.该病毒的毒价为10TCID50/0.1mL,即10TCID50/mL3.294.29（七）空斑试验将适当浓度的病毒悬液加入单层细胞中培养，当病毒吸附细胞后，再覆盖一层融化的琼脂。病毒在细胞内复制后产生局限性病灶，病灶逐渐扩大，肉眼也能看见，此即空斑(plaque)。空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的，类似于细菌的菌落，称为空斑形成单位（PFU）。病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升含有的PFU来表示。

CELLS复习思考题1.细胞培养病毒有何优点？2.解释原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系的概念。3.细胞培养方法有哪些？在培养过程中应注意哪些问题？4.解释CPE、空斑、PFU、TCID50的概念。5.如何测定病毒的TCID50？病毒感染的检查方法电镜技术血清学试验分子生物学技术病毒的分离鉴定标本采集与送检一、标本采集与送检原则：1.尽早采取：发病初期

2.部位适宜：由感染部位采取

3.冷藏速送：装有冰块或干冰的容器内（一）供分离病毒、检出核酸及抗原的标本（二）检测特异性抗体的标本

采集双份血清病毒材料采集与检验结果的关系采取标本的时期检查病毒及其成分测定抗体潜伏期及前驱期刚发病或急性期恢复期及康复期较难查见最多查见很难查见未增多未增多或增多不明显明显增多（常超过4倍）二、常规分离与鉴定病毒分离是诊断病毒感染的金标准，一旦阳性，即可确诊。不适用于快速诊断，操作复杂，实验成本高，阳性检出率低等有时不得不分离病毒，例如发现了一种新的病毒病，必须分离病毒进行研究，或者分离株的鉴定对流行病学有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫苗，或者希望获得天然弱毒株等。（一）病毒分离标本采集杀灭杂菌（青链霉素）接种鉴定病毒种型易感动物出现病状鸡胚病变或死亡细胞培养细胞病变三大方法（二）病毒鉴定1.形态学鉴定观察CPE。常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。正常细胞病变细胞2.血吸附和血凝作用感染细胞具有吸附红细胞的能力感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用红细胞吸附正常细胞（1）血吸附作用吸附试验可通过特异抗血清抑制来达到鉴定具有吸附特性的病毒（2）血凝作用血凝试验血凝抑制试验（3）病毒成分的直接检测用免疫学或分子生物学技术直接检查感染细胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。三、电子显微镜检查

病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。透射电子显微镜

1.正染法：超薄切片法取材固定戊二醛四氧化锇清洗与脱水浸透包埋聚合切片染色铀染铅染鸡痘病毒（超薄切片）超薄切片法的优缺点：优点：可观察病毒形态和形态发生过程缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存2.负染技术负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。铜网样品

滤纸染液（常用磷钨酸）1-2分钟后电镜观察口蹄疫病毒的电镜负染负染法的优缺点：优点：快速简易（10-20min）；分辨率高；图象清晰地病毒结构缺点：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有样品应处于悬浮状态免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。

3.免疫电镜技术(Immuneelectronmicroscopy，IEM)（1）免疫凝集电镜技术

抗原与抗体凝集反应后，可使标本中病毒颗粒聚集成团，再经负染直接在电镜下观察，提高了敏感性，确定病毒的血清学性质。（2）免疫电镜定位技术特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、过氧化物酶等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。

酶标记染色

四、血清学试验

是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用ELISA、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和发病组织中的病毒抗原。virus1.中和反应观察特异性抗体能否保护易感的试验动物防止死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应。2.补体结合反应

AgAb红细胞溶血素补体AbAg红细胞补体溶血素溶血（-）不溶血（+）待检系统指示系统3.琼脂扩散

4.标记抗体技术

根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称为标记抗体技术（labelledantibodytechnique）。

荧光抗体标记技术酶标抗体技术同位素标记抗体技术酶标抗体技术免疫酶组化法

冰冻切片上进行酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶标反应板上进行Ag+AbE

Ag-AbE+底物

产生有色产物Ag+Ab+AAbE+底物（1）间接ELISA（待检）Ab+Ag+AbE+底物（2）夹心ELISA（待检）3′3′5′5′3′3′3′3′3′3′5′5′5′5′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′模板DNA双链延伸（形成新的双链DNA）退火变性五、分子生物学技术聚合酶链反应（PCR）模板DNA引物（模板片段两端的序列）DNA聚合酶体外核酸扩增系统，类似于体内DNA复制过程2.核酸杂交技术核酸探针（probe）是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段，可检测待检样品中特定的基因顺序。标本滴加硝酸纤维素膜加热和碱处理变性标记的核酸探针杂交放射自显影或其他技术检测六、感染组织的组织学检查

病毒在光学显微镜下无法看到，但是在某些病毒感染细胞内出现包涵体，或者细胞形态发生变化，则对诊断有重要意义。如Negri氏包涵体是狂犬病犬脑细胞的特征。病理组织或渗出液作成涂片检查包涵体时，常用苏木紫-伊红染色法。狂犬病毒包涵体（Negribody）病毒的形态结构

弄清病毒的形态结构，对开展病毒的分类、起源及应用研究具有十分重要的意义。测量病毒的单位为纳米(nm)一般病毒大小在100nm左右测量病毒大小的方法

电子显微镜、过滤一、大小微生物的大小比较葡萄球菌(1000nm）

牛痘病毒300×250nmABCDEFG立克次体450nm衣原体390nmA、大肠杆菌噬菌体

(65×95nm)B、腺病毒

(70nm)C、脊髓灰质炎病毒

(30nm)D、乙脑病毒

(40nm)E、蛋白分子

(10nm

)F、流感病毒

(100nm)G、烟草花叶病毒二、形态病毒子（virion):一个形态和结构上完整的病毒颗粒。病毒的形体及其微小，结构简单，但它们的形状却是形态各异，丰富多彩。1.病毒的个体形态多数呈球状或近似球状，少数为杆状、丝状或子弹状，细菌病毒（噬菌体）大多数呈蝌蚪状。2.病毒的群体形态包涵体噬菌斑空斑病毒粒子感染寄主细胞后，可形成大量病毒粒子和蛋白质构成的病毒群体，可用光学显微镜甚至肉眼观察到。（1）包涵体

病毒感染寄主细胞后，在细胞质或细胞核内所形成的在光学显微镜下可见的小体，多为圆形、卵圆形或不定形，称为包涵体。包涵体的本质病毒的聚集体病毒的合成部位病毒感染有关的蛋白质非病毒性包涵体（2）噬菌斑

噬菌体感染细菌后，使细菌细胞破裂死亡，连续的重复感染使大量的细菌死亡，这样，在培养细菌的平板上可以看到一个个透明不长细菌的小圆斑，这些圆斑由无数个噬菌体粒子组成的群体，称为噬菌斑。

人工培养的单层动物细胞感染病毒后，也会形成类似噬菌斑的动物病毒群体，叫做空斑。（3）空斑单层细胞空斑二、病毒的结构裸露病毒囊膜病毒病毒体结构模式图壳粒衣壳芯髓核衣壳囊膜囊膜病毒囊膜子粒核心：核酸→基因组genome→决定病毒遗传、变异和复制壳粒capsomere→衣壳capsid→保护、介导、抗原性囊膜envelope，囊膜子粒peplomere（纤突spike）→保护、介导、抗原性

病毒的结构病毒粒子核衣壳囊膜：有纤突

（基本结构）（非基本结构）芯髓衣壳（核酸）基因组：DNA/RNA，双股/单股，分段/不分段壳粒（形态亚单位）多肽（结构亚单位）三、病毒的化学组成核酸蛋白质脂质碳水化合物其他组成（一）核酸：决定病毒的遗传和变异。特点：（1）病毒只含一种核酸，构成病毒体的芯髓。（2）核酸类型多样化核酸可分单股（singlestranded）或双股（doublestranded）、线状（linear）或环状（circular）、分节段（segmented）或不分节段

mRNA的碱基序列作为标准，凡与此相同的核酸称为正股（positivesense），与其互补的则为负股（negativesense）。

核酸线状、分节段核酸双股环状（3）分子量小，基因组结构简单，所含基因组数目少。（4）病毒基因组核酸复制多样化病毒核酸能作为mRNA或者能利用宿主细胞的

RNA聚合酶转录病毒的mRNA病毒核酸不分节段（6）有些病毒去除囊膜和衣壳，裸露的DNA或RNA

也能感染细胞，这样的核酸称为感染性核酸。具备条件：（5）病毒核酸更易受宿主细胞的影响而发生基因突变和重组（二）蛋白质组成蛋白质的氨基酸及顺序决定着病毒株的差异，表现在抗原决定簇则决定其免疫特异性。病毒的蛋白质根据是否存在于病毒颗粒中分为结构蛋白和非结构蛋白。

2.结构蛋白：系指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质。包括壳体蛋白和囊膜蛋白等。

1.非结构蛋白：指由病毒基因组编码的，在病毒复制或基因表达调控过程中具有一定功能，但不结合于病毒颗粒中的蛋白质。⑴壳体蛋白

构成病毒的壳体，保护病毒的核酸。

无囊膜病毒的壳体蛋白参与病毒的吸附、进入，决定病毒的宿主嗜性，同时还是病毒的表面抗原。

是构成病毒壳体结构的蛋白质，由一条或多条多肽链折叠形成的蛋白质亚基，是构成壳体蛋白的最小单位。

功能：

⑵囊膜蛋白

是病毒的主要表面抗原，它们与细胞受体相互作用启动病毒感染发生，有些还介导病毒的进入

还可能具有凝集脊椎动物红血球细胞、细胞融合以及酶等活性

基质蛋白构成膜脂双层与核衣壳之间的亚膜结构，具有支撑囊膜、维持病毒

构成病毒囊膜结构的病毒蛋白质，包括囊膜糖蛋白和基质蛋白两类。

功能：

蛋白质功能：保护病毒核酸，使其免受核酸酶或其它理化因素的破坏参与病毒感染细胞的过程，决定病毒对宿主细胞的亲嗜性抗原性：诱导特异性抗体、致敏淋巴细胞的产生（三）脂质许多病毒囊膜内存在有脂类化合物，如磷脂、脂肪酸、甘油三酸脂和胆固醇等。这些脂类几乎都是由病毒粒子在细胞内成熟，在细胞膜处以出芽方式释放，直接从寄主细胞膜上得到。病毒脂类存在与病毒的吸附和侵入有关。

（四）碳水化合物

除病毒的核酸中所含戊糖外，有的病毒还含有少量的碳水化合物，为核糖或脱氧核糖和磷酸组成的核酸骨架。有囊膜病毒中碳水化合物以寡糖侧链的形式与蛋白质结合形成囊膜糖蛋白。

（五）其它组成

在某些动物病毒中存在多胺类有机阳离子，包括丁二胺、亚精胺、精胺等，它们大都结合于病毒核酸，对核酸的构型有一定影响。在某些病毒的病毒体中，还发现有其它的小分子量组份，如ATP，对噬菌体尾鞘收缩提供能量。

四、病毒的分类命名

国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonmyofViruses,ICTV)是国际公认的病毒分类与命名的权威机构。

1.病毒分类系统第7次分类报告在部分科基础上建立了3个目，其中1个尾病毒目（Caudovirales）涉及噬菌体，2个涉及动物病毒，分别是单负股病毒目（Mononegavirales）和套式病毒目（Nidovirirales）。分类系统:目、科（亚科）、属和种分类阶元构成。科和属是病毒分类系统的最主要单位。2.病毒的命名与书写规则病毒的命名要由公认的国际专家小组负责不采用拉丁文双名法，而是英文或英语化的拉丁文，只用单名被ICTV正式认定的病毒名，用斜体书写;一般通用名则用正体

例:减蛋综合征病毒，学名为DuckadenovirusA（鸭腺病毒甲型），兽医界通用名Eggdropsyndromevirus。目、科、属分别用拉丁文后缀“-virales”、“-viridae”及“-virus”

如Circoviridae环状病毒科

Circovirus环状病毒属复习思考题绘出病毒的结构示意图，并说明各部分名称。解释包涵体、噬菌斑、空斑的概念何谓感染性核酸？构成感染性核酸需具备哪些条件？病毒由哪些化学成分组成？病毒的分类系统及命名书写规则。病毒的致病机制病毒的干扰现象理化因素对病毒的影响

病毒的致病作用与干扰现象一、病毒的致病机制

对细胞损伤是病毒建立感染的第一步细胞损伤和死亡是动物机体出现病理变化和临床症状的重要原因动物被病毒感染后一般产生免疫反应

阻断细胞大分子的合成病毒蛋白的毒性作用细胞溶酶体膜通透性增高，释放水解酶细胞免疫反应导致细胞损伤激活细胞的死亡基因，诱导细胞发生凋亡（一）细胞水平1.杀细胞性感染（CytocidalInfections）细胞破坏、死亡。多见于裸露病毒引起的感染。细胞凋亡（apoptosis）

病毒感染细胞直接作用或编码蛋白间接地作为诱导因子，激活细胞死亡基因，导致细胞凋亡（细胞膜鼓胀、染色质浓缩、边缘化）

感染犬瘟热病毒凋亡的Vero细胞的电镜照片2.稳定状态感染细胞膜结构和功能改变，主要见于囊膜病毒引起的感染。此类病毒以出芽方式释放，细胞病变相对较轻，短时间内并不立即导致细胞死亡，但可导致以下几种情况：（1）细胞膜抗原改变：如出现病毒抗原。可被特异性抗体和Tc细胞识别，通过免疫应答导致感染细胞的损伤和破坏。（2）细胞膜融合：有囊膜的病毒出芽过程中能将其融合蛋白直接插入宿主细胞膜，结果导致膜融合以及合胞体形成，细胞功能发生障碍。合胞体（syncytia）是病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞细胞膜融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为多核的巨细胞。

Formationofmultinucleatedcells.（3）细胞内形成包涵体有些病毒感染细胞可使细胞内出现包涵体，影响细胞的正常功能，导致细胞死亡。包涵体的形态、位置和染色性可在光学显微镜下观察，有助于病毒感染的诊断。3.整合感染整合感染的细胞可发生一定的变化，如形态变化、代谢变化及膜表面出现新抗原整合感染与病毒致肿瘤性有密切关系某些DNA病毒或某些RNA病毒经反转录酶形成cDNA整合于细胞基因组，并随细胞的分裂而增殖，这种整合宿主基因组的病毒基因组称为前病毒（provirus)，这种感染形式称为整合感染。（二）机体水平1.炎症反应病毒结构蛋白等可刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，由于炎性T细胞释放的细胞因子等的趋化作用，使病毒入侵部位聚集大量吞噬细胞，对病毒感染细胞进行吞噬、杀伤，造成炎症反应。2.免疫病理损伤病毒感染可以引起机体的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型变态反应。3.病毒对免疫系统的损伤有些病毒如HIV感染的靶细胞是T淋巴细胞和巨噬细胞，可以导致获得性免疫缺陷。由于免疫系统的损伤，机体不能彻底清除病毒，造成病毒的持续性感染。二、病毒的干扰现象

一种病毒感染动物机体（或细胞）后能产生抑制他种病毒再感染的作用，这种现象称为病毒的干扰现象。破坏了宿主细胞的表面受体或改变了代谢途径，从而阻止另一种病毒的吸附或穿入阻止第二种病毒mRNA的转译缺损型干扰病毒颗粒的干扰干扰素（一）干扰机制由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。（二）干扰素（IFN）（一）种类α型干扰素白细胞产生β型干扰素成纤维细胞产生γ型干扰素

T淋巴细胞产生（二）生物学活性抗病毒抗肿瘤免疫调节（三）作用特点广谱性：受一种病毒诱导产生的干扰素对所有病毒的复制均有抑制作用间接性：干扰素本身并无抗病毒作用，而是通过诱导细胞产生抗病毒蛋白发挥作用种属特异性：人的细胞只对人干扰素敏感，对动物细胞产生的干扰素不敏感干扰素不直接作用于病毒，而是作用于邻近的细胞，使其产生抗病毒蛋白，这些抗病毒蛋白降解病毒mRNA、抑制蛋白合成，从而终止病毒感染。（四）抗病毒作用机制干扰素抗病毒机制

三、理化因素对病毒的影响

温度

大多数病毒耐冷不耐热，在0℃以下能良好生存，特别是在-70℃和液氮温度下可长期保持其感染性。相反，大多数病毒于55-60℃，几分钟至十几分钟即被灭活，100℃时在几秒钟内即可灭活病毒。1、物理因素

干燥

干燥难以致死病毒，但能使感染力致弱。冷冻真空干燥可长期保存病毒。盐

有Ca2+、Mg2+存在，常可提高某些病毒对热的抵抗力。在减毒活疫苗中须加稳定剂。

pH大多数病毒在pH6-8的范围内比较稳定，而在pH5.0以下或者pH9.0以上容易灭活。但各种病毒对pH的耐受能力有很大不同，病毒对pH的稳定性常被用于病毒鉴定的指标之一。

辐射

电离辐射中的γ射线和χ射线以及非电离辐射中的紫外线都能使病毒灭活。

2、化学因素

脂溶剂：

有包膜病毒对脂溶剂敏感，借此可以鉴别有包膜病毒和无包膜病毒。

氧化剂、卤素、醇类：

H2O2、漂白粉、高锰酸钾、甲醛、过氧乙酸、次氯酸盐、酒精、甲醇等均可灭活病毒。

抗生素和中草药：病毒对抗生素不敏感，加入抗生素可抑制样品中的杂菌，有利于病毒分离。有些中药如板兰根、大青叶、柴胡、大黄、贯仲等对某些病毒有抑制作用。

复习思考题1从细胞水平和机体水平上阐述病毒的致病机制。2何谓干扰素？阐述其抗病毒的机制。

病毒的感染与防治病毒的感染及感染类型病毒病的免疫预防病毒病的药物治疗病毒侵入动物机体，并在一定部位生长繁殖从而引起机体不同程度的病理过程。一、病毒的感染（一）病毒感染成功的基本条件1.病毒的感染性指病毒能够进入敏感细胞内，并能在其中生存的一种特性。一定种类的病毒在一定的条件下，能在宿主体内引起感染的能力称为致病性利用柯赫法则可确定病毒的致病性

（1）致病性（pathogenicity）

病毒致病力的强弱程度，是量的概念，同一病毒的不同毒株，其毒力不一样，因此，毒力是毒株的特征。毒力的表示方法：半数致死量（LD50)、50%组织细胞感染量（TCID50）（2）毒力（virulent）2.宿主机体的易感性细胞表面的病毒受体宿主机体的免疫状态其他因素

营养和年龄因素取决于3个因素：二、病毒感染的类型潜伏感染慢性感染慢发病毒感染

病毒的特性及机体免疫应答的状态决定了病毒感染机体的类型。1.急性感染2.持续性感染1.急性感染后病毒被宿主的免疫系统清除临床上所见的绝大多数病毒感染均为急性感染。感染性病毒水平感染时间病毒基因组存在于一定的组织或细胞中，不产生有感染性的病毒体，在某些条件下可被激活而急性发作。急性发作期可以检测到病毒的存在。2.潜伏感染感染性病毒水平感染时间

显性或隐性感染后，病毒未完全清除，可持续存在血液或组织中并不断排出体外，然而一般不引起发病。感染全过程可检出或分离到病毒。感染时间感染性病毒水平3.慢性感染病毒感染后潜伏期长，既分离不到病毒，也不表现症状，但经过数年后病程呈进行发展并最终死亡。

感染时间感染性病毒水平4.慢发病毒感染三、抗病毒免疫非特异性免疫抗体介导免疫作用细胞免疫作用（一）非特异性免疫反应机械和化学屏障单核吞噬细胞和自然杀伤细胞炎症和发热反应年龄与生理状态遗传因素与种属免疫（二）抗体介导的免疫作用（三）细胞免疫作用特异性抗体可以中和存在于宿主细胞外的病毒TC分泌穿孔素、淋巴毒素等，杀伤靶细胞

获得性免疫天然获得性免疫天然被动免疫天然主动免疫人工被动免疫人工主动免疫人工获得性免疫五、病毒感染的免疫预防

（1）灭活疫苗(inactivatedvaccine）用物理或化学方法将病原体杀死而仍然保留免疫原性制成的疫苗称死疫苗或灭活疫苗。（2）活疫苗(livingvaccine）用人工定向变异或直接从自然界筛选出来的毒力减弱，或由基本无毒的活病原体制成的称为活疫苗，亦称为减毒活疫苗。1传统疫苗

疫苗2新型疫苗

（1）亚单位疫苗（subunitvaccine)

从病毒粗抗原中分离提取某一种或几种具有免疫原性的生物活性物质，加以纯化制备的疫苗。（2）基因工程亚单位疫苗（recombinantsubunitvaccine）

将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核或真核细胞中，使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原肽，提取纯化制成的疫苗。（3）基因工程活载体疫苗（recombinantlivingvectoredvaccine)

应用基因工程技术将保护性抗原基因（目的基因）转移到载体中使之表达的活疫苗。（4）基因缺失疫苗（genedeleted

vaccine）

用基因工程技术将强毒株的毒力相关基因切除构建的活疫苗。（6）核酸疫苗（nucleicacidvaccine)

将编码保护性抗原的基因导入能在真核细胞内表达的表达载体，直接进行免疫接种的疫苗

（5）合成肽疫苗（syntheticpeptidevaccine)

用化学合成法人工合成病原微生物的保护性多肽，连接到大分子载体而制备的疫苗六、病毒性感染的药物治疗1.核苷类似物阿糖腺苷类无环鸟苷二羟丙氨甲基鸟嘌呤叠氮脱氧胸苷（一）化学药物金刚烷胺-------抑制病毒脱壳-----预防感冒2.其他类型抗病毒药物（二）干扰素及其诱生剂（三）中草药直接抑制病毒增殖或通过增强机体特异和非特异免疫力而发挥抗病毒作用。病毒的培养动物接种鸡胚接种细胞培养一、鸡胚接种一种比较经济简便的方法。卵壳壳膜（1）保证不携带病原微生物，最好是SPF胚（2）对分离的病毒无母源抗体1.选择禽胚的标准接种日龄：同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。如尿囊腔接种多为9～11日龄，而绒毛尿囊膜接种多为10～13日龄。

接种途径：不同病毒的增殖有不同的接种途径，不应伤及胚体和血管，以免影响其发育。严格防止禽胚污染

鸡胚接种时严格无菌操作。2.接种

鸡胚绒毛尿囊膜接种法

尿囊腔接种法

鸡胚卵黄囊接种法3.鸡胚接种的优缺点：优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大，不需特殊设备

缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。

人或动物细胞在一定条件下可在实验室的培养瓶内生长。细胞培养(cellculture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进行培养。

二、细胞培养细胞培养迅速发展的原因：由于胰蛋白酶和螯合剂的应用，使组织细胞分散而不受损伤综合培养基的发展抗生素的应用绝大多数病毒都能在细胞中生长优点：每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等无个体差异，准确性和重复性好可严格执行无菌操作细胞培养本身就能显示病毒的生长特征应用空斑技术可进行病毒的克隆化根据细胞的来源、染色体特征及传代次数，可分为三种类型：（一）细胞的类型原代细胞二倍体细胞传代细胞动物组织经胰蛋白酶消化处理，使细胞分散而得到的细胞。优点：最适合病毒的分离缺点：易含潜伏病毒1.原代细胞

原代细胞培养剥离组织机械破碎细胞过滤洗涤细胞胰酶消化计数、培养2×104-4×104/mL将长成单层的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其染色体数与原代细胞一样，保持其二倍染色体数目的细胞，称为二倍体细胞。优点：细胞碎片少，细胞均匀，潜伏病毒易发现，对病毒的敏感性与原代细胞相似，而且容易得到。2.二倍体细胞能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而成。优点：容易培养，生长迅速，随时可获得缺点：对病毒分离不太敏感，不能用来制备疫苗3.传代细胞细胞的传代培养细胞单层细胞分散分瓶培养

胰酶消化细胞的冻存细胞单层细胞沉淀细胞冻存细胞分装调细胞浓度1×106-1×107mL

胰酶消化4℃2h；-70℃15h；液氮冻存液：含20%FCS、10%DMSO的营养液细胞的复苏冻存细胞速溶换液

37℃培养移入细胞瓶

37℃水浴加含20%FCS营养液4h后培养至单层

静置培养(stationaryculture)旋转培养(rollerculture)悬浮培养(suspensiveculture)微载体培养(micro-carrierculture)（二）细胞培养方法静置培养：实验室常用。细胞悬液装瓶，5%CO2温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。2.旋转培养：大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转（5-10r/min)，细胞帖附于玻瓶四周，长成单层。3.悬浮培养

通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。4.微载体培养是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。

微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收培养液和化学反应，细胞可贴附其上长成单层。由于微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述常规方法大为增加，对规模化的细胞或疫苗生产很有吸引力，但增高了生产成本。微载体有若干型号，已商品化。

培养液：RPMI-1640、199、DMEM等

血清细胞接种量pH：细胞生长的pH值为6.6～7.8，最适7.0～7.4温度：最适温度与细胞来源的动物体温一致无菌条件培养器皿清洁度（三）细胞培养要素血清成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。血清使用：目前国内多用犊牛血清，使用前须经56℃灭活30min，并进行细胞毒性试验。生长液血清含量一般为5％～20％。维持液中血清量为0%～5％。细胞接种量细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少，这些物质分泌量少，而作用也小。接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多对细胞生长也不利。一般为10万-

100万／m11细菌污染：营养液很快混浊，细胞死亡脱落2真菌污染：培养液中可见黄白色小点状悬浮物，镜检时可见菌丝结构。

3支原体污染：最常见，污染率为50％～60％4病毒污染：①组织带毒②培养液带毒（四）细胞培养污染问题1血清：维持液内犊牛血清含量一般不超过2％。2温度：多数37℃。3pH：一般在7.6～7.84病毒接种剂量：一般按维持液的1～10％(V／V)量接入。接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价；接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。

5病毒接种方法：异步接毒和同步接毒。（五）细胞培养病毒要素（六）病毒增殖指标与收获1.细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)由病毒感染导致的细胞损伤。CPE能在光学显微镜下观察。①细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等；②细胞聚合，如腺病毒；③细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；④有些病毒能形成包涵体。正常细胞CPE2.病毒收获CPE达80％时收获，反复冻融多次使病毒释放，然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20℃保存。测定病毒感染力的方法半数致死量LD50(50%lethaldose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(50%egginfectivedose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50%tissuecultureinfectivedose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）：用细胞来检测50%组织细胞感染量（