平板电泳仪校准规范

JJF1654—20171平板电泳仪校准规范1范围本规范适用于平板电泳仪(水平板电泳仪和垂直板电泳仪)计量性能的校准,对于其他类型的电泳仪,可参照本规范执行。2引用文件本规范引用了下列文件:JJG124—2005电流表、电压表、功率表及电阻表JJF1071—2010国家计量校准规范编写规则GB/T29248—2012基础电泳装置凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规范。3术语和计量单位3.1漂移drift在规定的工作条件下,单位时间内电泳仪输出电压或电流的变化量。3.2电泳谱带electrophoresisspectrum电泳后载体上的样品所形成的条带。3.3迁移距离migrationlength规定电泳条件下电泳谱带中心和加样孔中心的距离,单位毫米。4概述电泳是指在分散体系中,荷电粒子在外加电场的作用下,向电极定向移动的现象。电泳仪是利用带电粒子如核酸、蛋白等物质的带电性质不同,在同一电场条件下其移动方向和迁移率不尽相同的原理实现对带电粒子分离与鉴定的仪器。平板电泳仪通常分为水平板和垂直板两类,一般由电源、电泳槽等主要部件以及制胶、冷却部分等辅助部件组成。5计量特性5.1示值误差5.2漂移5.3迁移距离重复性6校准条件6.1环境条件JJF1654—20172环境温度:(15~35)℃。相对湿度:不大于75%。6.2校准设备及标准物质6.2.1电源校准装置经检定合格的标准电压表、标准电流表。最小分辨力:电压≤0.1V,电流≤0.1mA。6.2.2有证标准物质300bp片段DNA标准物质(Ur≤3%,k=2);细胞色素C相对分子质量标准物质(U≤20,k=2)。6.2.3游标卡尺经检定合格的游标卡尺,分度值(分辨力)≤0.05mm。7校准项目和校准方法7.1示值误差7.1.1输出电压示值误差按照图1方式连接电路,将平板电泳仪电源设为恒压模式,依次测定最大工作电压的10%、20%、30%、50%、80%时输出电压,每个校准点分别重复测量3次,计算其算术平均值,按公式(1)计算输出电压示值误差。(1)式中:(1)式中:ΔU—平板电泳仪输出电压示值误差,V;U—平板电泳仪输出电压示值,V;Us—平板电泳仪输出电压实测值的平均值,V。图1电压测试电路示意图7.1.2输出电流示值误差按照图2方式连接电路,将电泳仪电源设为恒流模式,依次测定电源最大工作电流10%、20%、30%、50%、80%处的输出电流,每个校准点分别重复测量3次,计算其算术平均值,按公式(2)计算输出电流示值误差。3图2电流测试电路示意图(2)式中:ΔI=I-Is(2)ΔI—平板电泳仪输出电流示值误差,mA;I—平板电泳仪输出电流示值,mA;Is—平板电泳仪输出电流实测值的平均值,mA。7.2漂移按照图2方式连接电路,将平板电泳仪电源的输出电压(电流)设定为150V(50mA),采用电压表(电流表)监测其30min内的电压(电流)变化,记录电压表(电流表)显示的最大值和最小值。按公式(3)计算电压(电流)的漂移。式中:X=Xmax-Xmin(3)X—电压(电流)的漂移;Xmax—最大电压(电流);Xmin—最小电压(电流)。7.3迁移距离重复性7.3.1水平板电泳仪将琼脂糖凝胶和适量1×浓度的琼脂糖凝胶电泳缓冲液放入电泳槽,电泳缓冲液以高出凝胶表面(1~2)mm为宜。取浓度为10ng/μL片段DNA标准物质溶液32μL与5×DNA上样缓冲液8μL均匀混合配制工作标准溶液。移取5μL工作标准溶液加载到胶孔中,平行加载6个样品孔,盖好电泳槽盖子。根据电泳槽大小按7V/cm的标准选择适当的电泳电压,运行30min或当色素距凝胶前端约1/5处时,停止电泳。随后将凝胶样品放在成像系统下成像(如果之前没有加入染料,在进行此步骤之前需要将凝胶放入适当染料中染色30min)。按公式(4)计算片段DNA标准物质谱带的平均迁移距离重复性(RSD)。RSD=1×d(di-1×di=1n-1×100%(4)JJF1654—20174式中:di—i泳道标准物质迁移距离,mm;n—泳道数;d—标准物质谱带的平均迁移距离,mm。7.3.2垂直板电泳仪将SDS-聚丙烯酰胺凝胶放入垂直板电泳仪,加入适当1×浓度的Tris-Glycine电泳缓冲液,以高出凝胶表面(1~2)mm为宜。将细胞色素C相对分子质量标准物质配制成1mg/mL的标准物质溶液与0.1%溴酚蓝溶液1∶1混合,100℃加热5min,将混合溶液离心10s后平行加入6个样品孔中,每孔10μL。选择80V电压开始电泳,当溴酚蓝条带进入分离胶后,电压提高至120V,当溴酚蓝条带接近凝胶前端约1/5处时停止电泳,从电泳槽中取出凝胶,采用考马斯亮蓝染色法进行染胶。随后将样品放在成像系统下成像并按公式(4)计算细胞色素C相对分子质量标准物质谱带的迁移距离重复性。8校准结果表达经校准后的平板电泳仪应填发校准证书,校准证书应符合JJF1071—2010中5.12的要求。校准证书至少包括以下信息:a)标题,如“校准证书”或“b)实验室名称和地址;c)进行校准的地点(如果不在实验室内进行校准);d)证书或报告的唯一性标识(如编号),每页及总页数的标识;e)送校单位的名称和地址;f)被校对象的描述和明确标识;g)进行校准的日期,如果与被校结果的有效性和应用有关时,应说明被校对象的接受日期;h)如果与校准结果的有效性和应用有关时,应对抽样程序进行说明;i)对校准所依据的技术规范的标识,包括名称及代号;j)本次校准所用测量标准的溯源性及有效性说明;k)校准环境的描述;l)校准结果及测量不确定度的说明;m)校准证书或校准报告签发人的签名、职务或等效标识以及签发日期;n)校准结果仅对被校对象有效地声明;o)未经实验室书面批准,不得部分复制证书或报告的声明。9复校时间间隔平板电泳仪复校间隔建议一般不超过1年。由于复校时间间隔的长短是由仪器的使用情况、使用者、仪器本身质量等诸因素所决定的,因此,送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔。如果对仪器的检测数据有怀疑或仪器更换主要部件及修理后应对仪器重新校准。JJF1654—20175附录A水平板电泳仪校准溶液的配制A.11×琼脂糖凝胶电泳缓冲液的配制准确称取10.8g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、5.5g硼酸、4mL0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0),加入超纯水(18.2MΩ·cm)溶解定容至1000mL。A.2琼脂糖凝胶的配制A.2.1将干净的胶床、胶板,形成一个胶模放置在水平平面上。A.2.2根据胶板的体积[胶厚取(5~7)mm],取适量1×电泳缓冲液,并按2%(W/V)的浓度称取相应质量的琼脂糖,加热煮沸、振摇2~3次,使琼脂糖充分融化,直至溶液清澈透明。A.2.3当凝胶温度降至60℃左右时,加入适量的GELRED(1∶10000;V/V),摇匀并倒入胶模中,除掉气泡,插入梳子。A.2.4室温下静置待凝胶完全凝固后拔出梳子,将胶板放入电泳槽中。JJF1654—20176附录B垂直板电泳仪校准溶液的配制B.11×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制准确称取3.02g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、18.8g甘氨酸、1g十二烷基硫酸钠(SDS),加超纯水(18.2MΩ·cm)溶解定容至1000mL。B.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配制B.2.1根据表B.1配置凝胶储备液,4℃保存备用。表B.1SDS-聚丙烯酰胺凝胶储备液溶液名称储备液丙烯酰胺混合液(A液)29.2g丙烯酰胺;0.8g甲叉双丙烯酰胺;加超纯水(18.2MΩ·cm)至100mL分离胶缓冲液(B液)75mL2mol/LTris-HCl(pH8.8);4mL10%十二烷基磺酸钠(SDS);21mL超纯水(18.2MΩ·cm)堆积胶缓冲液(C液)50mL1mol/LTris-HCl(pH6.8);4mL10%十二烷基磺酸钠(SDS);46mL超纯水(18.2MΩ·cm)注:丙烯酰胺是神经毒素,应避免沾溅到皮肤,操作时必须戴手套。B.2.2分离胶:取5mLA液、2.5mLB液及2.5mL蒸馏水在烧瓶内混合均匀,随后加入10%过硫酸铵溶液50μL和四甲基乙二胺5μL,轻轻搅拌使其均匀混合。B.2.3将分离胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm时停止,在分离胶溶液上覆盖一层(1~5)mm的水层,使凝胶表面变得平整,静置(30~60)min,使凝胶聚合。B.2.4堆积胶:取2.7mLA液、2.5mLC液和4.8mL蒸馏水在烧瓶内混合均匀,随后加入10%过硫酸铵溶液50μL和四甲基乙二胺5μL轻轻搅拌使其混匀混合。B.2.5将堆积胶溶液用吸管加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。将梳子插入凝胶内至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐(必须确保梳子齿的末端没有气泡,将梳子稍微倾斜插入可以减少气泡的产生)。凝胶聚合30min后拔出梳子,注意不要将加样孔撕裂。JJF1654—20177s=(s=(nU-iU)2=0.7V(C.2)实际校准时在规定条件下连续测量3次,以3次测量结果的算术平均值作为结果,不确定度计算引用10次测量结果的标准偏差,则其不确定度分量为:电压示值误差校准的不确定度评定示例C.1电压示值误差的测量模型式中:ΔU—式中:ΔU—平板电泳仪输出电压示值误差,V;U—平板电泳仪输出电压示值,V;Us—平板电泳仪输出电压实测值平均值,V。C.2不确定度来源及其标准不确定度评定不确定度的来源包括测量重复性引入的不确定度和电压表本身引入的不确定度。C.2.1测量重复性引入的标准不确定度在规定的电压条件下,重复测定10次电压数据,如在示值100V的条件下,得到的测试数据:100.2V,100.8V,101.4V,100.6V,101.6V,102.1V,101.8V,102.3V,101.6V,102.0V,则测量结果的标准偏差s为: uA=0.4V(C.3)C.2.2标准电压表引入的标准不确定度根据标准电压表的检定证书,查得该标准电压表的最大允许误差为±0.2%,服从均匀分布k=3。则标准电压表引入的确定度分量为:uB=0.12VC.3合成标准不确定度C.4扩展不确定度uc=u+uC.4扩展不确定度取k=2,则平板电泳仪100V校准结果的扩展不确定度为:注:电流和迁移距离的不确定度评定可以参考电压的不确定度进行评定注:电流和迁移距离的不确定度评定可以参考电压的不确定度进行评定。(C.4)(C.5)(C.6)JJF1654—20178附录D校准原始记录推荐格式送检单位:校准日期:年月日仪器名称:制造厂:型号:出厂编号:证书编号: