生化笔记第二部分核酸化学

核酸化学一、核酸种类和组成单位1、依据核酸化学组成和生物学功效,将核酸分为:核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸(DNA)全部细胞都同时含有DNA和RNA两种核酸。病毒只含一个核酸,DNA或RNA,故有DNA病毒和RNA病毒之分。多数细菌病毒（噬菌体）属DNA病毒,而植物和动物病毒多为RNA病毒。DNA:关键存在于细胞核（真核细胞,98%以上）,是染色质关键成份;原核生物DNA关键存在于类核中;在核外也存在有少许DNA,如线粒体DNA、叶绿体DNA以及细菌质粒（细菌染色体外能够进行自我复制遗传单位）。RNA关键存在于细胞质中:mRNA:约占细胞总RNA5%,在蛋白质合成中起模板作用;rRNA:占细胞总RNA80%,是核糖体组分,是合成蛋白质场所;tRNA:占细胞总RNA10-15%,蛋白质合成中起携带活化氨基酸作用;2、组成:核酸是由核苷酸组成,核苷酸是核苷磷酸酯,核苷由碱基和核糖/脱氧核糖组成,碱基有嘌呤和嘧啶两类。DNA组成:脱氧核糖、磷酸、A、G、C、TRNA组成:核糖、磷酸、A、G、C、U（1）碱基:NH2OCH3OONH2OOONH2胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶鸟嘌呤腺嘌呤嘌呤和嘧啶环中均含有共轭双键,所以对波长260nm左右紫外光有较强吸收,这一关键理化性质被用于对核酸、核苷酸、核苷及碱基进行定性定量分析。（4）戊糖:DNA分子核苷酸糖是β-D-2-脱氧核糖,RNA中为β-D-核糖。（3）磷酸:生物体内多数核苷酸磷酸基团位于核糖第五位碳原子上。二、核酸分子结构（一）DNA分子结构1、一级结构DNA一级结构指是组成DNA分子脱氧核苷酸连接方法和排列次序。DNA是由很多个dAMP、dGMP、dCMP和dTMP经过3’,5’-磷酸二酯键连成无分支双链线状或环状多核苷酸。生物体性状由DNA决定,生物性状多个多样,所以在DNA一级结构上,一定是不一样段落有不一样功效,不一样生物性状由对应DNA片段来决定;核酸为多聚核苷酸,相邻2个核苷酸间以3’,5’-磷酸二酯键连接。DNA分子中链骨架是固定不变,脱氧核糖核苷酸排列次序实质上是碱基排列次序。核酸链简写式:核酸分子简写式可简明表示高度复杂核酸分子。简写式表示是核酸分子一级结构,即核酸分子中核苷酸（或碱基）排列次序。书写方法由5’→32、二级结构:DNA双螺旋结构是核酸二级结构。双螺旋骨架由糖和磷酸基组成,两股链之间碱基互补配对,是遗传信息传输者,DNA半保留复制基础,结构关键点:a.DNA是一反向平行互补双链结构亲水脱氧核糖基和磷酸基骨架位于双链外侧,而碱基位于内侧,碱基之间以氢键相结合,其中,腺嘌呤一直与胸腺嘧啶配对,形成两个氢键,鸟嘌呤一直与胞嘧啶配对,形成三个氢键。b.DNA是右手螺旋结构螺旋直径为2nm。每旋转一周包含了10个碱基,每个碱基旋转角度为36度。螺距为3.4nm,每个碱基平面之间距离为0.34nm。c.DNA双螺旋结构稳定维系横向靠互补碱基氢键维系,纵向则靠碱基平面间疏水性堆积力维持,尤以后者为关键。3、三级结构:三级结构是在双螺旋基础上深入扭曲形成超螺旋,使体积压缩。在真核生物细胞核内,DNA三级结构与一组组蛋白共同组成核小体。在核小体基础上,DNA链经反复折叠形成染色体。（二）RNA分子结构1、、tRNA结构:tRNA由73~93个核苷酸组成,分子量为25000~30000dalton,沉降系数4S,含较多稀有碱基（修饰碱基）,占总RNA16%,种类多。（1）一级结构:分子量最小,含75～90个核苷酸,3′－末端都含有CPCPAOH结构,即最终一个是腺苷（核糖3′位非磷酸化）;（2）二级结构:不一样tRNA含有相同高级结构,tRNA分子单股链经过本身折叠形成四个螺旋区和四个环基础结构,类似一个三叶草,称为三叶草结构。tRNA分子中含有氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和TYC环五部分。①氨基酸臂:7bp组成,富含G,5’-pG或pC,3’-CCA-OH,氨基酸连接在腺苷酸残基(A)上。②TψC环:由7个碱基组成,参与tRNA与核糖体表面结合。③额外环或可变环:碱基种类和数量（3~18个碱基）高度可变,并富含稀有碱基。环大小与生物种类相关,作为tRNA分类指标。④反密码子环:由7个碱基组成,处于中间位3个碱基为反密码子,常含有次黄嘌呤核苷酸。反密码子可与mRNA中密码子结合。⑤二氢尿嘧啶环:由8~12个碱基组成,具2个二氢尿嘧啶(DHU)。（3）三级结构:tRNA三级结构:tRNA三维结构是倒“L”形。（4）tRNA作用:是携带活化氨基酸参与蛋白质合成。2、mRNA结构真核细胞mRNA3′末端有一段可长达200个左右多聚腺苷酸,称为“尾”结构。表示为polyA5′;末端有一个甲基化鸟苷酸,称为“帽”结构。表示为:m7GPPPXmPY.这种“尾”和“帽”结构在mRNA功效中相关键作用。经典真核mRNA结构次序是:帽子结构区-5’非编码区-起始密码-编码-终止密码-3’真核生物mRNA一级结构特点:真核生物帽子结构复杂程度与生物进化程度关系亲密。mRNA5’-端帽子结构是mRNA翻译起始必需结构,对核糖体对mRNA识别提供了信号;这种帽子结构还可能增加mRNA稳定性,保护mRNA免遭5’→3‘核酸外切酶攻击,同时也与mRNA翻译活性相关。绝大多数真核mRNA3’-末端有一段长约200个残基Poly（A）。原核生物mRNA通常无此结构。Poly（A）尾巴是转录后在核内加上。Poly（A）尾巴功效可能与mRNA从细胞核转送到细胞质相关。不过相当数量没有polyA尾巴mRNA如组蛋白mRNA,也能经过核膜进入细胞质。这种结构可能对真核mRNA翻译效率含有某种作用,使mRNA较轻易被核糖体识别,并能稳定mRNA结构,保持一定生物半衰期。原核生物mRNA通常为多顺反子(polycistron),即在同一mRNA中含有编码多个蛋白质信息(一个基因即一个顺反子);真核mRNA通常是单顺反子,一个mRNA只能编码一条多肽链。3、、rRNA结构种类较多,分子中修饰成份较少;rRNA分子量为103~106D,存在于核糖体中,核糖体中有60%是rRNA,其它40%是蛋白质。原核生物大肠杆菌rRNA有5S、16S和23SrRNA三种,动物细胞有5S、5.8S、18S和28SrRNA四种三、核酸理化性质（一）、核酸通常性质1、溶解性RNA为白色粉末状,DNA是白色纤维状固体,二者均溶于水,而不溶于通常有机溶剂中,故常见冷乙醇从水溶液中将核酸沉淀出来。2、两性性质核酸是两性电解质,但酸性强,与金属离子结合成盐,也可与碱性蛋白（组蛋白）结合;介质pH大于4时,呈阴离子,电泳时向阳极移动;DNA在pH4~11间最稳定,超出此范围易变性。（二）核酸紫外吸收特征核酸分子中嘌呤和嘧啶碱基中含有共轭双键体系,所以含有特殊紫外吸收光谱,其最大吸收峰位于260nm处。利用这一性质可定量测定核酸含量或判定核酸纯度。（三）核酸变性及复性1、核酸变性⑴概念:核酸变性是指因一些理化原因影响使维持核酸空间结构氢键和疏水键断裂,双螺旋结构解体,但不包含核苷酸间共价键断裂。核酸变性后,粘度降低,紫外吸收值增高(增色效应),生物功效消失。⑵影响变性原因:破坏双螺旋稳定性原因都可使DNA变性。DNA分子中碱基处于配对和不配对动态平衡状态,很多原因会引发它向不配对方向转变,即引发DNA变性。如高温、强酸、强碱、有机溶剂(乙醇、丙酮等)、尿素、酰胺等试剂、射线等。高温:DNA稀盐溶液加热到80~100℃,几分钟内双螺旋键即解开,形成无规则线团。离子强度:提升溶液离子强度,可中和DNA分子链上磷酸基团负电荷,降低它们之间排斥力,稳定DNA结构。DNA通常保留在1molNaCl中。极端pH值:pH﹤1时,DNA磷酸二酯键会被水解;pH﹥11.3时,DNA全部氢键断裂。疏水作用:甲醇可增加碱基溶解度,三氟醋酸钠可降低DNA分子疏水作用,破坏双螺旋结构引发变性。⑶DNA熔点（Tm）:DNA热变性过程中光吸收达成最大吸收二分之一时温度称为DNA解链温度(简写Tm)或熔点,用Tm表示。DNATm值通常在70~85℃热变性是在很狭温度范围内突发跃变过程,很像结晶达成熔点时熔化现象,故名熔解温度。（4）Tm影响原因:DNA均一性高:Tm范围越小。DNA(G+C)含量:Tm值高低取决于DNA分子中(G+C)含量。(G+C)含量越高,Tm值越高。故测定Tm,可反应DNA分子中G,C含量。公式以下:(G+C)%=(Tm–69.3)×2.442、核酸复性⑴概念变性DNA在合适条件下(除去变性原因),可使两条分开链根据碱基配对规律重新缔合成双螺旋结构,这一过程称为复性。复性后DNA其理化性质和生物功效都得到部分恢复。复性DNA溶液紫外吸收下降称为减色效应。⑵影响复性原因①温度和时间通常认为比Tm低25℃左右温度是复性最好条件,越远离此温度,复性速度就越慢。复性时温度下降必需是一缓慢过程,若在超出Tm温度下快速冷却至低温(如4℃以下),复性几乎是及不可能,核酸试验中常常以此方法保持DNA变性(单链)降温时间太短以及温差大均不利于复性。②DNA浓度:浓度越大,复性越快。③DNA次序复杂性:简单次序DNA分子,如多聚(A)和多聚(T)这二种单链序列复性时,互补碱基配对较易实现。次序复杂DNA,如小牛DNA非反复部分,通常以单拷贝存在于基因组中,这种复杂特定序列要实现互补,显然要比简单序列困难得多。四、核酸分离与纯化（一）分离核酸通常标准提取时应注意以下几点:1、预防核酸酶降解:细胞内凡有核酸部位,都有降解该核酸酶存在。故应加入酶抑制剂降低其活性,如柠檬酸钠,EDTA等;2、预防化学原因降解:提取时常见到强酸强碱,要注意强酸强碱降解作用;3、预防物理原因降解:应在低温和避免猛烈搅拌下进行;（二）DNA分离纯化1、DNP蛋白提取细胞提取物加1mol/LNaClDNP溶解DNP溶解分离（DNP和RNP)RNP沉淀稀释NaCl至0.14mol/L离心DNP溶液DNP沉淀DNP蛋白2、除去DNP中蛋白质（1）SDS法SDS（十二烷基硫酸钠）可使蛋白质变性,从而使DNA与蛋白质分开;（2）苯酚法苯酚变性蛋白质在苯酚相,酒精DNP蛋白DNA在水相离心DNA沉淀3、DNA纯化（1）蔗糖密度梯度离心:分离分子量大小不等DNA（2）氯化铯密度梯度离心分离双链和单链DNA;（3）柱层析:分离天然DNA和变性DNA三.RNA分离纯化（三）RNA分离纯化1、