广西梨地方品种的遗传多样性研究

广西梨地方品种的遗传多样性研究齐丹现代农业产业技术体系建设专项(CARS-29-01)；中国农业科学院科技创新工程，曹玉芬1*，胡红菊2，王超1，常耀军1，田路明1，董星光1，张莹1，霍宏亮1，徐家玉1，刘超现代农业产业技术体系建设专项(CARS-29-01)；中国农业科学院科技创新工程1中国农业科学院果树研究所，农业部园艺作物种质资源利用重点实验室，辽宁兴城125100；2湖北省农业科学院果树茶叶研究所，武汉430064*通讯作者，E-mail:yfcaas@263.net摘要为评价广西梨地方品种的遗传多样性水平，对54份广西梨地方品种的叶绿体DNA高变区域accD-psaI进行测序。经比对后序列长度为683-936bp不等，检测出单倍型数量为6个，1个简约性信息位点，5个单一突变位点，5个插入/缺失InDels片段，单倍型多样性Hd为0.710，核苷酸多样性Pi为0.64×10-3。单倍型H1、H2和H3为常见单倍型，其中H1在广西各地分布最为广泛。Median-joiningNetwork图显示，单倍型H4和H5为原始单倍型，单倍型H2，H3，H8为较进化单倍型。2个原始单倍型均在横县地区的梨地方品种中检测到，同时横县地区的单倍型类型最多，推测横县地区为广西梨起源与多样性中心。关键词梨；地方品种；叶绿体DNA；遗传多样性AnalysisofgeneticdiversityofpearlandracesinGuangxiZhuangAutonomousRegionQIDan1,CAOYufen1*,HUHongju2,WANGChao1,ChangYaojun1,TIANLuming1,DONGXingguang1,ZHANGYing1,HUOHongliang1,XUJiayu1,LIUChao1,ZHANJunyu11ResearchInstituteofPomology,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofHorticulturalCrops;GermplasmResourcesUtilization,Xingcheng,Liaoning125100,China;2InstituteofFruitandTea，HubeiAcademyofAgriculturalSciences，Wuhan430064，China*Correspondingauthor,E-mail:yfcaas@263.netAbstract：Toinvestigatethegeneticdiversityleveloflocalvarieties,thehypervariableregionaccD-psaIofchloroplastDNAin54localvarietiesoriginatedinGuangxiZhuangAutonomousRegionweresequenced.Thelengthof54sequenceswerevariedfrom683to936afteraligning,andthenumberofhaplotypeswas6,thehaplotypediversityHdwas0.710,andthenucleotidediversityPiwas0.64×10-3.1parsimonyinformativesites,5singlemutationsites,5insert/deletion(InDels)fragments.HaplotypesH1,H2andH3werecommonhaplotypes,ofwhichH1wasmostwidelydistributedthroughoutGuangxi.TheMedian-joiningNetworkpictureshowedthathaplotypesH4andH5wereprimitivehaplotypes,andhaplotypesH2,H3,andH8weremoreevolvedhaplotypes.The2originalhaplotypesweredetectedinthelocalvarietiesofHengxianCounty,andthehaplotypesinHengxianareawerethemost.ItwasspeculatedthattheHengxianareawastheoriginanddiversitycenterofGuangxipearslandraces.Keywords:pear;landraces;chloroplastDNA;geneticdiversity我国是梨属植物的起源中心，也是栽培梨多样性中心之一，起源于中国的梨属物种有13种。广西位于我国梨树分布最南的地区之一，栽培品种均属砂梨系统，主要为7月中旬前后成熟的青皮砂梨和8月中下旬成熟的黄皮砂梨[1]。梨地方品种经过漫长的自然选择和人为选择，具有优异性状和生态适宜性，是梨育种的重要材料来源，对其遗传多样性水平的评价，可指导梨种质资源的收集、保护和利用。被子植物叶绿体DNA的非编码区域变异丰富且具有母系遗传的特性，基于此特性，近年来对叶绿体DNA的非编码区域的测序应用到遗传多样性[2]、系统发育、起源与演化[3]等研究领域，特别是accD-psaI基因间隔区域，岳小燕[4]利用这一基因间隔区福建省梨地方品种的遗传多样性，Ferradini[5]利用其分析古老的意大利梨地方品种的系统发育研究。本研究利用叶绿体DNA变异丰富的基因间隔区域accD-psaI，通过对54份广西梨地方品种该区域的双向测序，分析品种的亲缘关系和遗传多样性水平，并通过和42份梨主栽品种做比较，分析广西梨地方品种的起源与演化，为挖掘当地的特异梨种质，更好的保护地方品种，提高其在梨育种实践方面的利用提供理论依据。材料与方法材料2018年4月从国家果树种质兴城梨、苹果圃和国家果树种质武昌砂梨圃采集起源于广西的梨地方品种的54份作为供式材料，品种及叶绿体单倍型信息见表1。表1材料信息及单倍型种类Table1PlantmaterialsinformationandcpDNAhaplotypes编号种质名称起源单倍型编号种质名称起源单倍型1广西梨广西H328横县浸泡梨广西横县H32北流青梨广西北流H129母猪梨1号广西横县H43北流蜜梨广西北流H130母猪梨2号广西横县H44北流黄梨广西北流H331横县涩梨广西横县H45香蕉梨广西德保H132横县酸梨广西横县H56细皮糖梨广西恭城H133靖西糖梨广西靖西H17黄皮长把糖梨广西恭城H334靖西雪梨广西靖西H18青皮酸梨广西恭城H335靖西冬梨广西靖西H19黄皮酸梨广西恭城H336靖西青皮梨广西靖西H210黄皮雪梨广西恭城H637荔浦黄皮梨广西荔浦H111灌阳糖梨广西灌阳H138荔浦雪梨广西荔浦H112灌阳水南梨广西灌阳H139三门江黄梨广西柳城H313灌阳黄皮萼梨广西灌阳H140三门江沙梨广西柳城H314黄皮鹅梨广西灌阳H141柳城凤山梨广西柳城H315灌阳早禾梨广西灌阳H242柳城雪梨广西柳成H116灌阳大青皮梨广西灌阳H343黄细皮梨广西龙胜H117灌阳红皮梨广西灌阳H344黄粗皮梨广西龙胜H218灌阳青水梨GX3广西灌阳H345青皮梨广西龙胜H219粗皮糖梨GX10广西灌阳H346桂花梨广西龙胜H220灌阳雪GX12广西灌阳H347黄糖梨广西龙胜H321雁山六月梨广西桂林H148瑶山糖梨广西南丹H222雁山青皮雪梨广西桂林H249冰糖梨广西南丹H223全州梨广西桂林H350融安青雪梨广西融安H124南宁大沙梨广西横县H151融安黄雪梨广西融安H325横县灵山梨广西横县H152那坡青皮梨广西田阳H126横县大心梨广西横县H153苍梧大砂广西梧州H127横县蜜（绿）广西横县H254北流花梨广西武鸣H1DNA提取采用改良CTAB法提取基因组DNA，经1.2%琼脂糖凝胶和Nano-200（奥盛仪器有限公司，杭州）微量分光光度计检测，稀释浓度至50ng/μL备用。PCR扩增与测序对accD-psaI区域扩增的引物为5’-TTATTCGATCCAATCGTACCAC-3’和5’-AGAAGCCATTGCAATTGCCGGAAA-3’[6]对叶绿体高变异accD-psaI间隔区进行PCR扩增，扩增体系和PCR程序参照之前的研究结果[7]，经琼脂糖检测单一明亮条带，纯化后经公司测序（美吉生物有限公司，北京），正反双向测序，避免出现碱基错配的错误。数据分析利用MEGA7.0[8]软件进行序列比对，将比对后的结果保存成fasta格式，利用DnaSPver5.10.01[9]软件生成品种的单倍型类型，单倍型多样性Hd，核苷酸多样性Pi等；同时将54份广西地方梨品种的accD-psaI序列同Genbank上得到的该区域序列比对（42份梨品种，来自白梨、秋子梨、砂梨、新疆梨、西洋梨和选育品种），并利用软件Networkver4.6[10]构建Median-joiningNetwork图。结果与分析2.1accD-psaI序列信息和单倍型多样性对54个广西梨地方品种的叶绿体accD-psaI区域进行序列比对和人工校正，序列长度为683-936bp，单倍型数量为6，单倍型多样性Hd为0.710，核苷酸多样Pi为0.64×10-3，检测出简约性信息位点1个，单一突变位点5个，插入/缺失（InDels）5个，长度分别是1、2、10、22和229bp，6个单倍型序列之间的差异见表2。Tajima’sD值为1.299，P>0.10时不显著，目标序列在进化上遵循中性模型，序列可用于系统发育分析。表2单倍型H1~H6在accD-psaI区域的序列差异Table2mutationandInDelsinaccD-psaIregionofH1~H6305339-567399444521562-571628-629633636637-658742H10/229bpH21/1bp0/229bpH31/22bpG/CH4H5G/AH6C/TT/G0/10bp0/2bpT/AA/T注：0代表缺失，1代表插入，“/”后面是插入或缺失片段的大小。Note:0representeddeletion,1representedinsert,numberbehind‘/‘wasthesizeofInDel2.2梨cpDNA单倍型的分布在54份广西梨地方品种中共检测出6个叶绿体单倍型，即H1~H6，其中单倍型H1、H2和H3为常见单倍型，分别在23、9和17份梨地方品种中检测到，单倍型H4、H5和H6为稀有单倍型，分别在3、1和1份梨地方品种中检测到。根据梨起源地的不同划分小组，发现单倍型H1分布范围最广，单倍型H5和H6都只在1个地区的出现；起源于横县的梨地方品种的单倍型种类最多为5个，其次为恭城，其他地区为2~3个，一些地区因为梨样本数量少，仅检测到1种单倍型。表3单倍型H1~H6在广西各地区的分布Table3DistributionofH1~H6amongdifferentregionsinGuangxi编号地区数量H1H2H3H4H5H61北流3212德保113恭城51314灌阳104155桂林31116荔浦227横县9311318靖西4319柳城41310融安21111龙胜513112南丹2213田阳1114梧州1115武鸣1116未知11合并54239173112.3单倍型系统进化分析利用软件Network4.6构建单倍型间的Median-joiningNetwork图，叶绿体DNA的accD-psaI序列共96条，54条为广西梨地方品种的序列，其余42条序列为对照，来自Genbank的梨5大梨栽培系统和育成品种。随序列的增加在原有的6个单倍型的基础上，出现了2个新的单倍型H7和H8。单倍型H4和H5位于Median-joiningNetwork图的主干上，为原始单倍型，分别包含4和1个梨品种；mv1和mv2为可能存在的变量，H2、H3和H8位于最外端，是较进化的单倍型。原始单倍型H4和H5通过mv1和mv2延伸出3个分支，命为G1~G3，G1组含2个单倍型H1和H2，46个梨品种，与原始单倍型H4相比，含有长度为229bp的片段缺失；G2组由1个单倍型H3组成，含31个梨品种；G3组由3个单倍型H7、H6和H8组成，15个梨品种。图1单倍型H1~H8的Median-joiningNetwork图Fig1.Median-joiningNetworkofhaplotypesH1~H8为更好的了解广西梨地方品种的演化，将每个单倍型所包含的品种类型可视化，如图2所示，单倍型H4，H5，H7和H8的来源单一，H4和H5仅为广西地方品种构成，H7为新疆梨，H8为西洋梨；单倍型H1、H2、H3和H6的组成除广西地方品种外，也包含5个栽培梨系统的白梨、秋子梨、砂梨、新疆梨、西洋梨和育成品种；‘母猪梨1号’、‘母猪梨2号’、‘横县涩梨’和‘横县酸梨’4个地方品种的遗传背景单一，没有受外来品种的影响，而大部分的广西地方品种，在演化过程中同其他地区的梨种质资源发生了基因交流。图2单倍型H1~H8的品种构成Fig2.SpeciescompositionofhaplotypesH1~H8讨论比较使用同一叶绿体高变区域accD-psaI的研究结果发现，广西梨地方品种的单倍型多样性Hd为0.710，高于福建梨地方品种的0.660[5]，略低于湖北梨地方品种的0.720[11]，可见广西梨地方品种的遗传多样水平较高，处于福建和湖北两地的梨地方品种之间。梨属植物自交不亲和，不同种之间无生殖隔离，本研究中单倍型H6，包含了砂梨、新疆梨和西洋梨的栽培梨品种。梨基因组重测序的研究[12]推测新疆梨是东西方栽培梨的种间杂交后代，本研究利用的材料较少，也发现新疆梨具有东西方栽培梨的遗传背景。根据叶绿体DNA母系遗传的特性，发现一些母系遗传背景独特的地方品种，起源于恭城的‘黄皮雪梨’与一些新疆梨和西洋梨品种的叶绿体单倍型相同，明显区别于其他砂梨品种；起源于横县的‘母猪梨1号’、‘母猪梨2号’、‘横县涩梨’和‘横县酸梨’的单倍型为原始单倍型，在今后梨资源的保护和育种实践中，建议优先考虑这5个梨地方品种。同时横县的梨地方品种中检测到原始单倍型H4和H5，也是单倍型分布最广的地区，推测横县地区为广西梨地方品种的起源分化中心。参考文献蒲富慎，王宇霖.中国果树志·梨[M].上海：上海科学技术出版社：1963.ChenT,ChenQ,LuoY,etal.PhylogeographyofChinesecherry(PrunuspseudocerasusLindl.)inferredfromchloroplastandnuclearDNA:insightsintoevolutionarypatternsanddemographichistory[J].PlantBiol,2015,17(4):787-797.FerradiniN,LancioniH,TorricelliR,etal.CharacterizationandphylogeneticanalysisofancientItalianlandracesofpear[J].FrontiersinPlantScience,2017,8:751.XiaoyanY,Xiaoyan,YuZ,etal.CombinedAnalysesofChloroplastDNAHaplotypesandMicrosatelliteMarkersRevealNewInsightsIntotheOriginandDisseminationRouteofCultivatedPearsNativetoEastAsia[J].FrontiersinPlantScience,2018,9:591.岳晓燕,黄新忠,宗宇等.福建省梨地方品种的遗传多样性研究[J].园艺学报,2015,42(1):119-130.LiuJing,ZhengXiao-yan,PotterD,etal.GeneticdiversityandpopulationstructureofPyruscalleryana（Rosaceae）inZhejiangProvince,China[J].BiochemicalSystematicsandEcology,2012,45: