生化技术课件

离心分离借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离超速离心技术已成为分离、纯化、鉴别和各种生物大分子的重要手段之一一离心机的种类与用途转速分：常速（低速）、高速和超速1常速离心机<8000r/min,R.C.F<1*104g用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒2高速离心机1*104g～2.5*104r/min，R.C.F1*104g～105g用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等高速冷冻离心机3超速离心机2.5*104g～8*104r/min，R.C.F5*105g或更高结构：离心管帽、冷冻装置和温控系统、真空系统、安全保护系统、制动系统、指示仪表等。按用途分：制备用超速离心机：分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等分析用超速离心机：测定样品纯度（根据紫外吸收率或折光率等判断）、沉降系数、相对分子量沉降系数S：单位离心力作用下粒子的沉降速度，以Svedberg表示，简称S。1S=1*10-13s沉降系数S与分子量M有对应关系，测出离心机转速、离心时间和粒子移动距离，可求出S，再得到M二离心方法的选择对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心

1差速离心采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。2密度梯度离心样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。密度梯度系统：梯度介质有足够大的溶解度，不与分离组分反应，不会引起分离组分的凝集、变性或失活。常用介质：蔗糖、甘油等。样品铺在密度梯度溶液表面，离心后形成若干条界面清楚的不连续区带。3等密度离心当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，不同浮力密度的物质颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置（等密度点），形成区带。等密度离心常用的介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr三离心条件的确定离心力（转速）离心时间温度pH值

思考题1名词解释离心分离相对离心力沉降系数2按离心机转速分，离心机有哪些种类？各自的适用范围是什么？3超速离心方法有哪些？4离心操作应注意控制哪些条件？离心转速和沉降时间有何关系？过滤与膜分离技术过滤：借助一定孔径的过滤介质，将不同大小颗粒物质分离的方法。主要驱动力为压力差。常压过滤、加压过滤、减压过滤过滤介质：滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等助滤剂：硅藻土、活性炭、纸粕等条件控制：压力差、粘度、浓度、温度、pH等。生化中的膜分离技术膜分离技术是借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术。优点：能耗低、不经相转换、操作方便等。膜分离驱动方式：压力、浓度差、电动势、化学位能等。可分为反渗透、超滤、微滤、透析、电渗析等。

一压力差为推动力的膜过滤技术1分类（1）微滤（MF）截留颗粒直径0.2～2μm，可除去淀粉、细菌、霉菌、乳化油等。（2）超滤（UF）截留颗粒直径0.02～0.22μm，相当于分子量1000～5×105道尔顿。可滤出蛋白质、脂肪、病毒、树脂和色素物质。（3）反渗透被截留物质分子量小于1000道尔顿，只允许溶解质或水通过，被形容为脱水浓缩技术。2原理3操作注意问题（1）

膜的选择与安装（2）

溶液性质和流动状态（3）

浓差极化和膜堵塞（4）

温度、pH值选择（5）

膜的清洗4应用可单独或联合使用，达到以下目的：悬浮微小颗粒的除净；大分子溶质的除去；大分子溶液的浓缩；大分子溶液的分级等。微滤在食品饮料等的澄清和除菌中应用最广；超滤在生物大分子分级中应用越来越多，如浓缩提取菠萝蛋白、糖化酶、生物表面活性剂鼠李糖酯等，在果汁、蔬菜汁、牛奶等的浓缩和果酒等的澄清中使用广泛。

二其它膜分离技术1电渗析原理应用海水淡化、溶液脱盐等。可提高发酵液中谷氨酸收得率。2透析原理应用生物大分子分离纯化，除去小分子、脱盐等。实际应用例子：人工肾思考题什么叫膜分离技术？压力差为推动力的膜分离技术主要有哪些？膜分离技术有何应用？举例说明。萃取分离技术利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。一有机溶剂萃取注意防止变性：温度，接触时间1有机溶剂选择2操作：萃取，分离二双水相萃取双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。分配系数的大小决定了萃取分离的效果。可采取修饰高分子聚合物的方式提高分配系数。三超临界萃取超临界流体：在温度和压力超过某物质的超临界点时，该物质称为超临界流体。特点：介于液体与气体之间，溶解能力与液体接近，扩散系数接近于气体。应用311-ＣＯ２钢瓶2-注塞泵3-高压釜4-分离釜5-压力表图1超临界流体萃取沙田柚皮精油流程图245反胶束萃取将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，称为正常胶束。结构示意见图a。在胶束中，表面活性剂的排列方向是极性基团在外，与水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核心、在此核心可以溶解非极性物质。若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶束，其结构示意见图b。在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池”。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”。由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。蛋白质的溶解过程和溶解后的情况示意于图中。反胶束萃取的操作1表面活性剂与有机溶剂选择表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，它们都可用于形成反胶束。在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸－2－乙基己基磺酸钠。这种表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入。

2反相胶束的形成3萃取萃取条件：pH、离子强度、温度4反萃取思考题1名词解释萃取、双水相萃取、超临界萃取、分配系数、反胶束2了解超临界萃取技术的应用电泳技术1电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。2电泳技术优点：快速、准确、重现性好3电泳方法分类按电场分：常压（<500V，适用大分子）、高压（>500V，适用小分子）支持体分：自由电泳、区带电泳仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式4电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）一电泳的基本原理电泳分离：移动方向：带电性质决定泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。

μ＝v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt影响μ的因素：1颗粒本身：带电、大小、形状2外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等。二纸电泳以滤纸为支持体的电泳技术操作要点：1选择缓冲液对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响A分离蛋白质，pI≈5，选pH8.6的缓冲液（巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4)B分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸—醋酸，pH5.9C分离核苷酸巴比妥－醋酸pH2.5，柠檬酸pH2~3D分离糖类：HAC-NaAC,pH3~52滤纸的选择与处理层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。3点样点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品）干法、湿法4电泳电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间5显色及分析蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红BAa：茚三酮、靛红核酸：紫外光下观察一般洗脱定量三薄膜电泳支持体：薄膜优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、易于定量、便于保存广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析操作1薄膜的处理与放置2点样平衡3电泳：E10~25V/cm，0.5～2h4显色四薄层电泳将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳。常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等操作：1缓冲液选择离子强度较高的缓冲液2支持物处理精制品3薄层板制作4加样：挖沟、混合样品、填埋5电泳6分析：印染法五凝胶电泳支持物：多孔凝胶聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因：机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳1聚丙烯酰胺凝胶的制备丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）→（催化剂）→聚合催化剂：（1）过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED）（2）核黄素（VitB2）＋光改变单体浓度可改变凝胶孔径交联剂对孔径有影响：5％最小根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。2不连续电泳中样品压缩成层的原理不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝胶，用不同pH值的缓冲液：样品胶：大孔径，pH6.7～6.8Tris-HCl缓冲液浓缩胶：与样品胶相同分离胶：小孔径，pH8.8～8.9Tris-HCl缓冲液样品压缩成层原理：电极缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸HCl→(解离）→Cl－，Cl－泳动速度最快（快离子）CH2(NH2)COOH→(样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8）→CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢离子）蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间电泳时，Cl－超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P压缩成层样品进入分离胶后，pH为9.5（电泳过程实测），CH2(NH2)COO－增加，泳动速度增大，很快超过P，P在均一的电位梯度和pH条件下分离SDS-凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，P电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使P二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于P分子量。分离测定：测分子量（与标准蛋白比较）鉴定样品纯度（条带数目）测定样品P含量：扫描定量（比色）凝胶电泳的操作要点1凝胶制备2电极缓冲液3样品处理及加样4电泳5染色与固定6脱色7分析烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化六等电点聚焦电泳电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。P进入时，不同的P移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的P得以分离。优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的P。1稳定的pH梯度的形成2两性电解质载体要求：由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备（有不同pH范围的商品两性电解质载体）3支持pH梯度的介质密度梯度溶液（用于自由电泳）凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）4操作要点

pH梯度支持介质的制备聚焦电泳检测两性电解质载体的除去电泳技术思考题1名词解释电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电泳、相对迁移率、不连续凝胶电泳2影响泳动度的主要因素有哪些？3区带电泳的操作步骤一般有哪些？4如何制备聚丙烯酰胺凝胶？5不连续电泳样品压缩成层原理。6SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。7采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何测定蛋白质等电点？

化学检测根据物质的化学性质而对物质进行定量、定性测定。应用最早、最广泛的检测技术简便、快速、操作容易一糖类的化学检测糖类包括多糖、双糖、单糖单糖和某些双糖具有游离羰基——还原糖多糖和蔗糖等无还原性——非还原糖糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。非还原糖必须转化为还原糖再进行测定最常用的试剂：斐林（Fehling）试剂基本组成：A：CuSO4溶液

B:NaOH和酒石酸钾钠溶液使用时A、B等体积混合(生成酒石酸钾钠铜）酒石酸钾钠铜是氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应，而进行糖的测定。定糖常用方法1兰——爱农（Lane-Eynon）法次甲基蓝（亚甲基蓝、四甲基蓝）法、置换法、直接滴定法反应终点用次甲基蓝指示剂显示（还原糖滴定斐林试剂，由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量1D还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失）多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定如淀粉，可用酸解或酶解操作要点（1）斐林试剂的标定（a）标定预备试验

A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1％或0.2％）V1mL。（b）标定A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V0(2)定糖（a）定糖预备试验A、B各5mL＋10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1％或0.2％）V2mL。（b）定糖A、B各5mL＋10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V(3)计算还原糖含量（以葡萄糖计）＝（V0-V)×c×(1/10)×n注意：（a）AB分开储存，防止Cu++变化，临用混合（b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净（c）体积需控制在一定范围内，对pH有影响（d）煮沸时间要一致（e）注意指示剂加入时间和加入量一致（f）滴定速度一致（后滴定0.5～1mL，1min内完成）（g）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热

斐林试剂快速法：在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。反应终点比兰－爱农法更为明显。2碘量法I2→NaIO(氧化剂），其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应操作要点：（1）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05mol/L，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。（2）标准碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液＋15mL0.1mol/LNaOH＋5mL空白液，摇匀后暗反应15min＋1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.5％淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，记录V0(4)样品滴定：以5mL样品液代替空白液，V1(5)计算：醛糖含量＝（V0

－V1）C×M×n注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）3铜试剂法将还原糖与二价铜离子反应生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。（1）铜试剂的配制主要提供二价铜离子及碘（2）标准曲线的制作（a)标准葡萄糖液的配制

0.1%或0.05％（根据所用铜离子试剂定）（b)三角瓶编号123456

葡萄糖标准液（mL)012345

蒸馏水（mL)543210

铜试剂（mL)555555

沸水浴10min，冷却至室温（c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振荡，待红色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸钠滴定至终点，记录耗用量V(d)绘标准曲线葡萄糖含量（mg）为纵坐标，（V0-V)为横坐标二蛋白质和氨基酸的化学检测蛋白质含氮量几乎恒定，平均16％测出N含量×6.25，即为蛋白质量含氮量每gN相当P

肉、蛋、豆16％6.25面粉17.6％5.70奶品15.7％6.38花生18.2％5.50鲑精蛋白31.5％3.17蛋白质常用检测方法1定氮法（经典的，仲裁的）常用凯氏定氮法或微量凯氏定氮法（1）原理消化、蒸馏、吸收、滴定计算（2）操作要点

(a)消化：凯氏定氮瓶，样品＋K2SO4-CuSO4、浓H2SO4,通风厨内进行，消化液全部移入100mL容量瓶定容。(b)蒸馏：防止漏气(c)吸收：5mL2％H3BO3＋甲基红－溴甲酚绿几滴或一定量标准酸溶液（如25mL0.05mol/LH2SO4)(d)滴定计算：

H3BO3吸收：0.01mol/LHCl滴定至绿色→淡紫红色样品中的总氮量（mg)=（A-B)×C×14×n

标准硫酸接收：0.1mol/L标准NaOH滴定，甲基红→黄色终点样品中总氮量=（C1V1-C2V2)×14×n粗蛋白含量＝样品的总氮量×6.252双缩脲试剂法测定蛋白质缩脲＋CuSO4、NaOH→紫红色化合物A∝C缩脲蛋白质含有两个以上脲键，有双缩脲反应蛋白质（多肽）＋CuSO4→（NaOH）→铜－钠－双缩脲络合物A∝Cp，与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关Tris缓冲液干扰P的测定，测定范围1～10mg/mL操作：（1）双缩脲试剂的配制

CuSO4、酒石酸钾钠、NaOH、0.1%KI(2)标准曲线的制作1％标准酪蛋白(mL)00.20.40.60.81.0蒸馏水(mL)1.00.80.60.40.20双缩脲试剂(mL)444444室温反应30min测A540(3)样品测定1mL＋4mL双缩脲试剂，30min，测A5403福林－酚试剂法测定蛋白质含量双缩脲法的发展，灵敏100倍，需时较长，对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更大，酚类和柠檬酸也有干扰。碱性铜试剂——双缩脲反应稀释的苯酚试剂——与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反应呈蓝色两种呈色反应可叠加操作：（1）福林－酚试剂的配制甲液：碱性铜试剂（A、NaOH、NaCO3,B、CuSO4和酒石酸钾钠)乙液：稀释的苯酚试剂（2）标准蛋白溶液配制结晶牛血清蛋白溶于0.9％NaCl或用酪蛋白（凯氏定氮法测定含量）（3）标准曲线制作（4）样品测定1mL样品（含P15～500μg）＋5mL甲液，室温10min，＋乙液0.5mL，混匀，室温30min，测A500~750蛋白质的免疫化学检测概念：免疫化学检测、抗体、抗原、凝集反应、沉淀反应检测方法：（1）凝集反应效价测定，细菌、病毒分类（2）沉淀反应沉淀反应、界面（环状）试验、免疫扩散、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光检测等氨基酸含量测定方法1茚三酮显色法微酸性条件下，氨基酸茚三酮反应生成紫色化合物，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）茚三酮反应生成黄色化合物取1mL样品溶液（含氨基酸0.1～50ug)加1mL缓冲液（pH5.0～6.7），再加1mL茚三酮显色液，100℃

水浴15min，自来水冷却后，加入3mL60％乙醇溶液，测定OD570，脯氨酸或羟脯氨酸测OD4402甲醛滴定法测定氨基酸氨基酸是两性电解质，不能用一般酸碱指示剂通过氢氧化钠来测定。加进甲醛生成羟甲基衍生物，可以用碱滴定。注意：需用过量中性甲醛。三核酸的化学检测根据核酸所含的磷及戊糖的化学性质，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等进行检测。1定磷法测定核酸含量（1）核酸的消化（2）磷的测定定磷试剂，45℃水浴25min，冷却至室温测OD650

无机磷标准液作标准曲线（3）核酸含量的计算一般DNA含磷9.5％,RNA含磷9.2％，RNA量＝（总磷量－无机磷量）×10.9DNA量＝（总磷量－无机磷量）×10.52二苯胺法测定DNA含量DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收峰。在40～400μg范围内，OD595与DNA浓度成正比。少量乙醛可提高反应灵敏度。（1）二苯胺试剂的配制（2）标准曲线制作（3）样品DNA含量测定3地衣酚法测定RNA含量核糖核酸在浓盐酸和三氯化铁的存在下，与3，5－二羟甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质。一定浓度范围内，OD670与RNA浓度成正比。所有戊糖均可进行此反应，注意干扰（如DNA）。操作：地衣酚试剂配制；标准曲线制作；样品RNA测定思考题1如何区别还原糖与非还原糖？举出常见的还原糖与非还原糖。2有哪些定糖方法？熟悉各种方法的原理，所用试剂和操作要点。3如何测定薯类淀粉含量？4蛋白质含量测定有哪些方法？熟悉各种方法的原理，所用试剂和操作要点。5如何用滴定法测定氨基酸含量？7如何用定磷法测定DNA或RNA含量？8二苯胺测定DNA和地衣酚测定RNA原理？9三瓶未知液分别为蛋白质、糖和RNA，如何鉴定？光学检测技术利用物质所具有的各种光学性质，对物质进行定性、定量及结构分析的技术。包括：旋光检测、析光检测、荧光检测、分光光度检测、散射光谱检测等。生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、荧光检测一分光光度检测又称分子吸收光谱检测，是利用物质分子所特有的吸收光谱而对物质进行定性定量测定的检测技术。紫外分光光度检测（200～400nm）可见光分光光度检测（400～760nm）红外光分光光度检测（760～10000nm）1样品溶液的配备（1）对各种光有选择性吸收特性的物质（2）本身没有颜色的物质，转变为有色的物质溶液2样品的检测选择好入射光的波长，空白液调零，测定。3待测物质的定性分析（1）将样品溶液在一定条件下（pH、温度、缓冲液等）测得的吸收光谱与物质的标准吸收光谱相对照，推断样品是什么。（2）根据样品吸收光谱中峰顶与峰谷吸光度之比值，与相当条件下资料所载的比值比较，推断样品是什么。如ATP:OD280/OD260=0.85,OD250/OD260=0.90AMP:OD250/OD260=0.85,OD280/OD260=0.22(3)将分光光度检测与层析或电泳分离技术相配合，综合判断。4待测物质的定量分析（1）标准曲线法注意：对于存在有干扰物质的样品要进行校正。（2）Lambert-BeerE=KCL,K-消光系数二旋光检测技术利用旋光计测量出旋光物质（光学活性物质）对偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋光检测技术。旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称为旋光度。左旋（－），右旋（＋）。物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此外与入射光的波长及温度有关，对溶液而言，还与溶液性质、溶液浓度和溶液厚度有密切关系。溶剂确定后，α

＝[α]tλLC/100α－旋光度L－溶液厚度（分米）[α]tλ

－比旋光度，通常采用[α]20D

L－溶液厚度（分米）

C－溶液浓度，100mL溶液中所含物质的克数。根据物质的[α]20D

和实际测出的α，可计算得到C=α×100/([α]tλL)操作要点：（1）样品液的配制（2）旋光度的测定旋光法测定味精浓度样品溶液配制精确称取味精样品10.00g，加40～50mL蒸馏水溶解，搅拌加入分析纯盐酸16mL，使味精全部溶解。冷却至室温，蒸馏水定容至100mL。旋光仪调零预热10min，放进滤光片。取16mL分析纯盐酸蒸馏水定容至100mL。装满旋光管，调整零点。样品液测定样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品室，测定旋光度，记录温度。计算C=α×100/([α]tλL)[α]tλ＝32＋0.06×（20－t)C味=C×187.13/147.13味精纯度＝C味/样品重量三荧光检测技术有些物质的分子吸收了一定波长的光（辐射能），分子内电子被激发到较高的能级以后，由于电子旋转或酸离解等消耗一部分能量，当电子返回到低能级状态时，重新放出较长波长的光，这就是荧光。不同物质放射的荧光光谱不同，荧光的强度与物质的浓度有关。检测方法直接检测荧光性物质利用非荧光物质与荧光试剂反应后检测在荧光性物质溶液中加入消光物质，测定荧光的减少常用物质测定的荧光试剂p183(自学）思考题生化中的光学检测方法主要有哪些?分光光度法如何对物质进行定性定量?旋光法如何测定光学活性物质含量(计算)?荧光检测中蛋白质和氨基酸常用的荧光试剂是什么?气体检测技术利用物质在生化反应或化学反应中放出或吸收气体的性质，通过测量气体量的变化而对物质进行定性定量分析的技术。广泛应用于细胞呼吸、酶反应动力学、氧化还原反应以及氨基酸、酮酸、尿素等的测定。检测的气体主要有氧气、二氧化碳、氮气。常用仪器：华勃氏呼吸仪、范•斯莱克检测仪华勃氏呼吸仪检压法原理恒温恒容的密闭系统中，利用气体压力的变化而测定气体变化量的方法。pV=nRTn=pV/(RT)=kpP－气体压强，用布氏液柱高度h(mm)表示。1标准大气压＝10000mm布氏液柱。标准状态下气体的体积变化X=khK为反应瓶常数1氧气吸收量测定反应系统总体积的测量布氏液配制加样品平衡测定计算2二氧化碳放出量的测定同时有二氧化碳的放出和氧气吸收，测定氧气吸收可在反应瓶中央小杯加入KOH吸收CO2；测定CO2放出量则可用两套检压计。生物检测技术采用生物体对被检测物质的特有反应而鉴定被检测物质的质量和功效的方法。生物体主要是各种微生物和某些动物。检测范围：生物效价和安全性实验一生物检测的主要内容生物检测常用标准样品对照法国际标准样品——联合国世界卫生组织生物检定委员会，丹麦哥本哈根血清所，伦敦国家医研所国家标准（参考标准）——本国制备，用国际标样校合，北京药品与生物制品研究所实验室对照样品——本室制备，要与国家标样、国际标样校合1生物效价测定效价：指某一物质引起生物反应的功效单位，可用理化方法检测，也可用生物检测方法测定。生物法：各类抗生素，维生素及氨基酸等生长因子。一个青霉素效价单位：能在50mL肉汤培养基中完全抑制金色葡萄球菌发育的最小青霉素剂量。一个链霉素效价单位：能在1mL肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌发育的最小链霉素剂量。国际标准单位IU，对纯的化学物质，可用重量来表示，如1mg链霉素能抑制1000mL培养基中大肠杆菌的繁殖，则含有1000IU，1IU=1μg2安全性试验（1）毒性试验：常用动物进行实验LD50（2）局部刺激性试验将被检药物注射进动物体内，观察在注射部位是否出现炎症或产生过敏反应等局部刺激现象。阳性——不能临床使用阴性——可供临床使用（3）溶血实验检测药物是否引起红血球膜破裂而释放出血红蛋白（4）热原试验检测药物中有没有使动物体温升高的致热性物质存在一般用家兔试验（5）过敏试验检测药物中有无引起过敏反应的物质存在的一种方法。过敏反应致敏原一般豚鼠或雄性小白鼠试验（6）变异原试验检测药物或食物中有没有引起生物产生变异的物质（变异原）存在。可用动物和微生物检测。二抗生素的生物检测

（生长抑制剂生物效价检测）有些可以用化学检测或光学检测法进行检测，广泛采用生物检测法。利用抗生素对特定微生物的生长起抑制作用而进行检测的技术。可用于已知抗生素的效价测定，也可用于检出未知的抗生素。方法：稀释法，扩散法1稀释法将样品和标准抗生素分别进行不同稀释度的稀释，加入培养基中，用指定的适当的菌株接种，培养后比较微生物的生长情况，从而测定样品的效价。固体平板，接入相同量指示菌，比较生长菌落数；液体培养基，接入相同量指示菌，比较OD值。还可测抗生素的最低抑菌浓度和半致死剂量LD502扩散法利用扩散作用形成连续的浓度梯度，试验菌在最低抑菌浓度范围内生