DB21-T 3007-2018绒山羊胚胎移植技术操作规程

ICS65.020.30

B43

备案号：61301-2019DB21

辽宁省地方标准

DB21/T3007—2018

绒山羊胚胎移植技术操作规程

Regulationsforoperationtechnologyofembryotransferofcashmeregoat

DB21/T3007—2018

绒山羊胚胎移植技术操作规程

1范围

本规程规定了辽宁绒山羊胚胎移植技术的操作规范。

本规程适用于辽宁绒山羊胚胎生产及移植技术操作。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T4630辽宁绒山羊

NY/T826-2004绵羊胚胎移植技术规程

NY/T1571-2007羊胚胎移植技术规程

NY/T1674-2008牛羊胚胎质量检测技术规程

NY/T2893-2016绒山羊饲养管理技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

绒山羊cashmeregoat

原产于辽宁省辽东半岛山区，体表长绒毛的山羊。

3.2

巴氏玻璃管Pasteurizedglasstube

即巴斯德玻璃管，是一种两端开口的玻璃管，一般用于转移液体。

4羊只选择与管理

4.1羊只选择时间与数量比例

胚胎移植前15d～30d，选择供体羊、受体羊以及种公羊。供体羊与受体羊的数量比例为1︰5～6。

4.2供体羊、受体羊选择与饲养管理

供体羊为年龄2周岁～5周岁的经产母羊，且符合辽宁绒山羊GB/T4630一级以上标准，系谱清楚准

确，健康无病，膘情适中，产羔后4个月以上，连续观察到2个以上正常发情周期。供体超排处理前15d

内不做免疫，单独组群饲养。

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DB21/T3007—2018

受体羊为年龄2周岁～5周岁的经产母山羊，健康无病，膘情适中。产羔3个月以上，连续观察到2

个以上正常发情周期。同期发情处理前15d内不做免疫，单独组群饲养。

供体羊与受体羊处理前15d～30d，除按照NY/T2893—2016标准饲养管理要求投喂饲料外，额外

补饲胡萝卜0.5Kg～0.6Kg/天·只，避免应激。

4.3种公羊选择与饲养管理

与配种公羊年龄2周岁～6周岁，符合辽宁绒山羊GB/T4630特级以上标准，系谱清楚准确。健康无

病，膘情适中，性欲旺盛，上一年度有繁殖记录。

种公羊配种前15d～30d，除按照NY/T2893—2016标准饲养管理要求投喂饲料外，需额外补饲胡

萝卜0.8Kg～1Kg/天·只，鸡蛋3枚～5枚/天·只，驱赶运动30min～40min/次，上下午各1次；配种

前1周～2周开始排精，3次～5次/周。

4.4试情公羊选择与管理

年龄2周岁～5周岁，性欲旺盛，健康无病，膘情适中。与供体羊、受体羊试情时，试情公羊要佩戴

试情布或试情板，防止误配。

5超数排卵与同情发情

5.1试剂耗材

供体羊超数排卵与同期发情试剂耗材：促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)或促黄体素释放激素A3

（LHRH-A3）、孕马血清促性腺激素(PMSG)、氯前列烯醇(PG)、维生素A+D+E注射液等；羊用孕酮阴道栓

（CIDR）及放置枪、75%酒精棉球、0.9%生理盐水、5mL注射器。

受体羊同期发情试剂耗材：LHRH-A3、PMSG、PG、维生素A+D+E注射液等；羊用CIDR及放置枪、75%

酒精棉球、0.9%生理盐水、5mL注射器。

5.2供体羊超数排卵与同期发情

胚胎移植一般宜在9月至11月进行。根据超数排卵及同期发情技术操作推荐程序（附录A），放栓时

每只羊肌肉注射维生素A+D+E2mL～3mL。利用放置枪将CIDR栓呈水平状态放入羊只生殖道内，操作过

程中严格消毒。放置CIDR栓当天计为0d。第11d开始每只羊肌肉注射FSH1mL（15mg～20mg）/次，

共8次，肌肉注射PG0.7mL～1mL。撤栓后12h开始公羊试情，间隔6h～8h；供体羊接受试情公羊爬

跨时，判定为发情，种公羊及时配种，首次配种后供体羊静脉注射LH50IU～100IU或肌肉注射促黄体

素释放激素A320ug～25ug,每天配种3次～4次，直至供体羊不接受爬跨为止。记录供体羊发情时间及

配种时间。

5.3受体羊同情发情

与供体羊同步实施同期发情。放栓时肌肉注射维生素A+D+E2mL～3mL/只。按照同期发情技术程

序肌肉注射PMSG200IU～250IU/只，撤栓。同期发情技术操作推荐程序见附录A。

6胚胎移植

6.1准备

6.1.1胚胎操作液

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胚胎操作液用于胚胎冲取、拣胚、鉴定和移植等，一般选用磷酸盐缓冲液（PBS）。PBS液可使用市

售成品或自行配制，主要成份与配制方法见附录B。

6.1.2手术器械

可升降式羊用手术车、可移动式手术器械车、无影灯、水浴锅。手术盘，手术刀柄与刀片，直头及

弯头止血钳，直头及弯头手术剪，持针钳，固定钳，剃须刀片，镊子，中号圆针，中号棱针等器械，将

上述器械用蒸馏水清洗干净，牛皮纸包装后，120℃、30min条件下高压灭菌后待用；术前在0.1%

新洁尔灭液中浸泡30min，使用前用灭菌的0.9%生理盐水冲洗。

6.1.3手术药品与耗材

甲硝唑注射液、青链霉素、碘酊（棉球）、75%酒精（棉球）、矿物油、兽用麻醉药846合剂、兽

用苏醒药盐酸苯恶唑、结晶磺胺、新洁尔灭、0.9%生理盐水；乳胶手套、手术服、口罩、鞋套、手术

无菌洞巾、中号丝线、敷料、喷壶、注射器（50mL、10mL、5mL、1mL）。

6.1.4拣胚、移植设备与耗材

立体显微镜、腹腔镜及配件、水浴锅、控温加热台、集卵杯、35mm培养皿、10#冲胚管、巴氏玻璃

管、16#套管针、7#输液器皮针、细玻-塑料管、钝型针、记号笔、0.22um滤器、微量移液枪(1mL、200

uL)、枪头（1mL、200uL）、酒精灯、75%酒精、95%酒精、面巾纸、铝饭盒、白钢盘等。

巴氏玻璃管等玻璃器具用清水洗净后，依次采用浓硫酸中浸泡24h、流水冲洗30min、洗涤剂刷洗、

流水冲洗1h、蒸馏水冲洗5次、超纯水冲洗5次后，放置于干燥箱中烘干，用牛皮纸包装，120℃、30min

条件下高压灭菌待用；铝饭盒、白钢盘等依次采用流水、蒸馏水冲洗，枪头（1mL、200uL）装盒，用

牛皮纸包装，120℃、30min条件下高压灭菌待用。

6.2供体羊胚胎冲取

6.2.1场所要求

待术羊圈应靠近准备室。准备室是用于手术羊只保定、剃毛、消毒等术前处理的场所。手术室紧挨

准备室，胚胎操作室以窗口与手术室相通，用于胚胎捡取、鉴定分级及装移植管等胚胎操作。手术室与

胚胎操作室术前紫外线照射消毒1h～2h，室温保持在20℃～25℃。各室间需采取物理措施隔离，术

前用0.2%新洁尔灭消毒液对地面喷洒擦拭消毒。

6.2.2胚胎冲取时间

供体羊于计划周期的第17d，对2～8细胞期胚胎手术冲取；早期囊胚于第21d冲取。

6.2.3手术准备

术前羊只禁食不少于24h，可饮水300mL～500mL，上下午各1次。将羊只仰面保定于手术架上，

头下尾上，固定四肢；在乳房延向腹部长约20cm宽约15cm为术区，用弯头手术剪剪除术区绒毛，用剃

须刀片将短毛剃净，清洗术区皮肤、晾干。每只羊按0.01ml/kg体重肌肉注射兽用麻醉药846合剂，待

羊只头部自然下垂时，用固定钳将无菌洞巾四角与皮肤固定，用碘酊（棉球）对皮肤消毒，2min～3min

后75%酒精（棉球）对涂碘酊区皮肤脱碘。注射麻醉药后，注意羊只状况，防止口腔异物窒息。手术

前用0.1%溶液浸泡3min～5min洗手消毒，再用灭菌生理盐水冲洗。

6.2.4手术冲胚

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DB21/T3007—2018

6.2.4.1输卵管冲胚

在距乳房约5cm的腹中线一侧，避开血管，用手术刀纵向切开皮肤长约8cm～10cm，用手术柄将

皮下脂肪及腹肌分离，直至腹膜，零星出血处用敷料压迫止血，若有血管破裂出血用直头或弯头止血钳

止血，敷料清创。轻轻将腹膜做一切口，用剪刀将腹膜剪开长约5cm～8cm左右切口；术员手部消毒后，

食指及中指伸入腹腔，将子宫角拉出至创口外，适当牵拉卵巢，观察排卵情况，做好记录。将细玻-塑

料管的玻璃管端从左侧输卵管伞口送入约3cm左右，捏紧伞口与套管并固定，塑料管端准备用集卵杯收

集冲胚的操作液。用7#输液器皮针在宫管结合部往输卵管伞方向30°刺入3cm左右，确定针位于输卵管

腔内，注射器取10mL～20mL胚胎操作液，再与输液器皮针相连，匀速持续推注操作液，观察液体回收

情况，如遇阻力时可调整皮针或玻璃管位置；冲胚完成后皮针刺入点若出血需用敷料按压止血，卵巢及

输卵管表面点滴少许矿物油后，送入腹腔。右侧胚胎冲取同上。两侧冲取完毕后，腹腔内注入甲硝唑液，

关闭创口。创口沿腹部至乳房方向，用中号圆针、丝线连续缝合腹膜肌肉层，避免伤及腹腔内器官；创

口撒放适量结晶磺胺粉，用大号棱针、丝线结节缝合皮肤层，缝线间距1cm左右；皮肤缝合完毕后，向

其表面喷洒适量碘酊液或碘酊（棉球）消毒，3min～5min后用75%酒精（棉球）脱碘；肌肉注射兽用

苏醒药（盐酸苯恶唑）0.02mL～0.04mL/kg体重。术后羊只肌肉注射消炎类药品，每天2次，连续施药

3d～7d。胚胎回收及移植记录表见附件C。

6.2.4.2子宫角冲胚

切口操作同输卵管冲胚。将左侧子宫角拉出创口，调整角度位置牵拉卵巢，观察排卵情况，做好记

录。用消毒回型针头在左右子宫角分叉处扎一口，将10#冲胚管往输卵管方向送入约3cm～5cm，向球

囊内注入2mL～4mL空气，确认充盈的球囊与子宫角腔完全紧实密封，冲胚管另一端与集卵杯相连准备

接收冲胚操作液。在宫管结合部避开血管扎一口，将16#套管针套管从口往子宫方向送入约3cm～5cm，

确认针位于子宫角腔内，捏紧子宫角与套管并固定。注射器取50mL胚胎操作液，与套管另一端相连，

匀速持续推注操作液，观察液体回收情况，如遇阻力时可调整针的位置，冲胚完成若有出血需先敷料按

压止血后，用35℃生理盐水清洗，卵巢子与宫角表面滴矿物油，送入腹腔。右侧胚胎冲取同上。其他

缝合等操作同上。胚胎回收及移植记录表见附件C。

6.3捡胚与鉴定分级

6.3.1准备

打开热台电源开关，设置温度38.5℃。拣胚管可购买市售成品，也可自制。自制捡胚管时，在火

焰上拉伸巴氏玻璃管，距管肩部2cm～5cm左右火焰烘烤，使之形成30°角；断针，断口内径200um～

300um，并做钝化处理。在3个～5个35mm培养皿内分别加入2mL胚胎操作液，做好编号标记。

6.3.2拣胚

集卵杯静置3min～5min，立体显微镜20×倍率下，根据胚胎的形态、大小、折光性辨别寻找胚胎，

注意集卵杯边缘处胚胎的存在，在拣胚管中先吸入一小段胚胎操作液，再拣取胚胎，放入含胚胎操作液

的35mm皿内，一般拣取2遍。捡取完后将胚胎在胚胎操作液中洗涤3遍，操作中要避免胚胎丢失。洗涤

后进行胚胎质量检查，确定胚胎级别，做好记录。胚胎回收及移植记录表见附录C。

6.3.3鉴定分级

立体显微镜20×～40×倍率下仔细观察，根据胚胎的大小、形态、色调，卵裂球大小、数量、均匀

度，液泡，游离细胞等影响胚胎发育的因素，结合获取时的胚胎阶段，综合鉴定与分级。按照NY/T826

—2004、NY/T1571—2007和NT/T1674—2008的规定进行胚胎鉴定与分级。各发育期胚胎图例见附录D。

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6.4胚胎移植

6.4.1时间

2～8细胞期胚胎第17d手术移植于第15d发情受体羊只。早期囊胚第21d移植于第15d发情受体羊

只。术前羊只禁食12h～24h。胚胎与受体母羊匹配关系见附录E。

6.4.2器械、药品与耗材

器械、药品与耗材和供体羊手术相同。另需黄体酮。移胚管可购买市售成品，也可自制。自制移胚

管时，可将拉制的巴氏玻璃管（见自制拣胚管）另一端与乳胶管相连，乳胶管另一端与1mL注射器相连，

注意连接处要密闭。

6.4.3移植

6.4.3.1胚胎装移植管

先吸0.2mL空气，吸入约0.1mL胚胎操作液，再吸入约0.05mL～0.1mL空气，然后吸入含2枚～3

枚胚胎的操作液0.1mL，吸入约0.05mL～0.1mL空气，再吸入约0.1mL胚胎操作液，待用。胚胎装管

方法见图1。

操作液空气含胚胎操作液空气操作液空气

图1胚胎装移植管方法示意图

6.4.3.2手术移植方法

6.4.3.2.1输卵管移植

手术准备、打开腹腔、缝合等操作同供体羊胚胎冲取手术。

提拉子宫角观察卵巢黄体情况，正常黄体为卵巢表面火山口状红色突起，一般将胚胎移植到黄体侧，

无黄体不移植；根据受体羊发情时间与胚胎发育阶段分级情况确定移植胚胎，一般移植2枚～3枚，胚胎

装移植管。暴露卵巢和输卵管伞，在伞与卵巢系膜附近寻找输卵管口，将装入胚胎的移胚针送入约2cm～

3cm，匀力慢速推动注射器，将胚胎送入输卵管，并观察输卵管充盈状态，未充盈则移植失败，可重新

移植。肌肉注射黄体酮15mg～25mg，记录黄体、胚胎情况。见附录C。

6.4.3.2.2子宫角移植

6.4.3.2.2.1开腹手术法

手术准备、打开腹腔、缝合等操作同本文件供体羊胚胎冲取手术。

确定卵巢黄体、移植胚胎、胚胎装移植管等操作同输卵管移植。钝型针在子宫角避开血管扎一口，

将装入胚胎的移植针送入约2cm～3cm，确认针位于子宫角腔内，匀力慢速推动注射器，将胚胎送入子

宫角。肌肉注射黄体酮15mg～25mg，记录黄体、胚胎情况。见附录C。

6.4.3.2.2.2腹腔镜微创法

手术准备、缝合等操作同本文件供体羊胚胎冲取手术。

距乳房3cm～5cm，腹中线两侧3cm～5cm，避开血管用手术刀各做1cm～2cm切口，穿刺套管针

从切口穿透肌肉、腹膜直达腹腔，取出穿刺针；另一切口用穿刺针刺入，操作同上，穿刺时要避免伤及

腹内脏器，取出穿刺针，从切口送入弯头止血钳，备用。打开腹腔镜，将窥视镜从套管送入腹腔，止血

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钳配合寻找卵巢并观察黄体情况，确定卵巢黄体、移植胚胎、胚胎装移植管等操作同输卵管移植。用止

血钳将子宫角牵拉至切口外，钝型针在子宫角避开血管扎一口，将装入胚胎的移植针送入约2cm～3cm，

确认针位于子宫角腔内，匀力慢速推动注射器，将胚胎送入子宫角。肌肉注射黄体酮15mg～25mg，记

录黄体、胚胎情况。见附录C。

7术后观察

手术完成后，解除羊只四肢固定物，轻缓运至待术羊圈，苏醒后可站立行走，若出现复眠情况，可

驱赶促其苏醒。密切观察术后羊只状态，异常状况对症处理。

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AA

附录A

（资料性附录）

绒山羊供体羊超数排卵、供受体同期发情技术操作程序与计划表

周期供体羊受体羊相关准备

…选择供体，种公羊，加强饲养管理选择受体，加强饲养管理试剂耗材选购

肌肉注射维生素A+D+E，放置

0天肌肉注射维生素A+D+E，放置CIDR

CIDR

…注意观察，及时补栓注意观察，及时补栓

11天晚8︰00肌肉注射FSH

12天早晚8︰00分别肌肉注射FSH

早晚8︰00分别肌肉注射FSH，早8︰00肌肉注射PMSG；晚8

13天

晚8︰00肌肉注射PG︰00撤栓

14天早晚8︰00肌注FSH，早撤栓下午公羊试情

早8︰00肌注FSH，上下公羊试情，配

15天上下午公羊试情手术器械耗材准备

种即注LH或A3

胚胎操作液准备，器

16天上下午公羊试情，配种

械耗材消毒

17天2～4细胞胚冲取移植器械清洗处置

胚胎操作液准备，器

…

械耗材消毒

21天囊胚冲取移植器械清洗处置

22天术后观察、处置术后观察、处置

注：第17d输卵管冲取胚胎多为2～4细胞期胚胎，相应移植到第15d发情受体母羊输卵管；第21d子宫角冲取胚胎

多为囊胚，相应移植到第15d发情受体母羊子宫角；实际操作中可选择以上其中一种胚胎移植方法。

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BB

附录B

（资料性附录）

PBS成分浓度表与配制方法

成分浓度(按mmol/L)浓度(按g/L)

NaCl136.0mmol/L8.0g/L

KCl2.68mmol/L0.2g/L

KH2PO41.47mmol/L0.2g/L

Na2HPO4·12H2O（Na2HPO4）8.1mmol/L2.89（1.5）g/L

MgCl2·6H2O0.49mmol/L0.1g/L

丙酮酸钠0.33mmol/L0.036g/L

葡萄糖5.56mmol/L1.0g/L

CaCl2·2H2O（CaCl2）0.9mmol/L0.133（0.1）g/L

BSA4.0mmol/L3.0g/L

青霉素G钾盐0.06g/L

硫酸链霉素0.05g/L

酚红0.001g/L

注：配制方法

试剂耗材与设备

NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、丙酮酸钠、葡萄糖等分析纯以上

试剂。电阻值18MΩ以上的超纯水，使用前120℃、30min条件下高压灭菌。牛血清白蛋白（BSA）、

胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素、0.2mol/LNaOH液。1L容量瓶、烧杯、药匙、微量移液枪（1mL、

200uL）、枪头（1mL、200uL）、封口膜、0.22um滤器、硫酸纸、PH试纸、注射器（50mL、10ml、

5mL）、离心管（50mL、2mL）等。

超净工作柜、冰箱、高压锅、电子天平（0.0001g精度）等。

配制

按照NY/T826—2004、NT/T1571—2007和NY/T1674—2008标准配制，于胚胎移植手术前1天配制

好。

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CC

附录C

（规范性附录）

供体羊手术冲胚、胚胎回收、鉴定分级与受体羊胚胎移植记录表

供体胚胎回收与鉴定分级情况受体胚胎移植情况

供体羊左侧右侧左侧右侧

供体羊

发情时2～44～82～44～8备受体羊号/

号/公羊可用未受M数EBB数可用未受M数EBB数黄胚胎数/黄胚胎数/

间/手术回收胚胎胚胎回收胚胎胚胎注发情时间/

号胚胎精卵/分数//分胚胎精卵/分数//分体发育阶体发育阶

时间总数数/数/总数数/数/手术时间

数数级分级级数数级分级级数段数段

分级分级分级分级

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DD

附录D

（资料性附录）

各发育期胚胎图例

图D.1未受精卵

图D.22细胞期胚胎

图D.34细胞期胚胎

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图D.48细胞期胚胎

图D.5桑椹期胚胎

囊胚