肿瘤细胞外囊泡代谢组学研究进展

2022肿瘤细胞外囊泡代谢组学研究进展摘要细胞外囊泡(EV)能够携带包括核酸、蛋白和小分子代谢物在内的多种生物活性成分，其在肿瘤诊断与治疗中的价值已得到广泛认可。然而目前对于EV内含物的研究主要集中在RNA和蛋白质上，对于最能直接反映细胞状态的小分子代谢物在EV中的作用尚不明确。近年来EV代谢组学在肿瘤研究中逐渐受到了关注，尽管由于前处理复杂且代谢物含量较低，EV代谢组学研究仍存在诸多挑战，但其在调控肿瘤进展及作为肿瘤标志物方面的价值已逐步显现，有望为肿瘤的诊断与治疗提供新的靶点。细胞外囊泡(extracellularvesicl,esEV)是一种具有双层磷脂膜结构的囊泡小体，EV从其大小及分离方式上可以分为小细胞外囊泡(smallextracellularvesiclessEV)和大细胞外囊泡(largeextracellularvesicleslEV)，而从其产生方式上又可以分为外泌体、微囊泡、凋亡小体等［1LEV能够特异地将来源细胞的蛋白质、核酸和代谢物等物质包裹在内，它们作为EV携带的“货物”，一方面能够作为标志物反映来源细胞的状态，另一方面也能够在细胞间传递信息，诱导靶细胞的生命活动发生改变［2］。此外本团队的前期研究也证实EV在肿瘤的远处转移中也发挥着重要作用［3L细胞代谢的改变是肿瘤的重要特征，肿瘤细胞可以通过这些改变来满足自身快速生长的需求。小分子代谢物是与细胞表型和状态最直接相关的分子，随着研究的深入，人们越来越认识到了代谢组学在肿瘤中的重要价值［4］。然而目前肿瘤EV的相关报道大都集中于RNA和蛋白，EV代谢组学研究还相对欠缺。一、肿瘤来源EV的代谢组学特征首先，与来源细胞相比，EV含有更多的脂质（每毫克蛋白所含脂质约为细胞的8.4倍）［5］，且普遍存在胆固醇、鞘糖脂、鞘磷脂等脂质的富集［6］，这一点在前列腺癌［5,7］、结直肠癌［8］和乳腺癌［9］细胞来源的EV中都得到了证实。此外EV还会特异性富集一些脂质，例如有研究发现，溶血磷脂酰胆碱会在前列腺癌LnCap细胞来源的EV中富集，但其在LnCap细胞中的丰度却很低。此外不同EV亚类携带的代谢物组成也是不同的，有研究者认为糖脂和游离脂肪酸的富集是sEV的特征，而神经酰胺和鞘磷脂的富集则是1EV的特征［10］，另外Yang等［11］的研究也发现尿液来源的sEV与1EV的脂质组成存在差异性，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸等在sEV中比1EV中更丰富，造成上述差异的原因可能是不同EV亚类的发生方式不同。与正常细胞来源的EV相比，肿瘤细胞来源EV携带的代谢物也存在着差异，其中研究最多的是脂质。溶血磷脂能够通过多种不同的机制参与肿瘤进展［12,13］。目前有研究证明卵巢癌SKOV-3细胞来源的EV存在溶血磷脂酰胆碱的富集［14］，且高浓度的EV溶血磷脂酰胆碱还与乳腺癌较短的总生存期相关［15］。但也有研究发现一些溶血磷脂如溶血磷脂酰乙醇胺在肾细胞癌患者尿液来源的EV中丰度更低［16］。另有研究发现神经酰胺和鞘磷脂也会在某些来自肿瘤细胞的EV中富集［10］,且这一现象在黑色素瘤和肺癌细胞来源的EV中也得到了证实［17,18］。此外，胆固醇酯、酵母固醇和27-羟基胆固醇等脂质的富集也曾在肿瘤来源的EV中被报道［14,19］。相对而言，肿瘤来源EV携带的其他小分子代谢物的研究还相对较少。有研究发现与非肿瘤细胞相比，来自肿瘤细胞系的EV含有更多的氨基酸及其衍生物，其中脯氨酸和琥珀酸上调最为显著，另外该研究还发现在前列腺癌细胞和T细胞淋巴瘤细胞来源的EV中能够检测到更多的叶酸和肌酐［20］。此外还有研究发现来自头颈鳞癌细胞系UMSCC47培养上清液的EV富含腺苷等嘌吟代谢产物［21］，这一现象在胰腺癌中也有报道［22］。这些肿瘤EV携带代谢物的特异性改变（图1）为其作为肿瘤诊断标志物奠定了基础。不同肿瘤细胞来源EV的代谢物组成也发生着变化。例如，肝癌细胞系Huh7和间充质干细胞MSC来源的EV存在心磷脂的特异性富集，而脑胶质瘤细胞系U87来源的EV则被发现存在鞘磷脂的富集［10］。另外一项乳腺癌相关的研究也表明，与低转移性细胞相比，高转移性乳腺癌EV中不饱和二酰基甘油存在富集，脂质被选择性地装载到乳腺癌EV中［9］。此外，不同耐药表型［23］、不同肿瘤亚型［24,25］以及不同分化程度［26］肿瘤细胞来源EV所携带的代谢物也存在差异，这提示EV携带的代谢物还可能在肿瘤鉴别诊断中发挥作用，且特异性的EV携带的代谢物也许能够用于判断EV的来源。以上研究主要探索了细胞培养液中肿瘤来源EV的代谢组学特征，值得注意的是，虽然细胞培养液来源EV相对临床样本来源EV应有更好的一致性，但是有研究发现同种细胞不同氧浓度［22］、不同pH［17］、不同培养系统［6］等条件也会引起EV代谢组学的变化，可见EV代谢组学是一个非常灵敏的指标，所以在比较不同细胞系EV携带的代谢物的过程中，也需要考虑不同培养条件对其产生的影响。综上，肿瘤来源EV的代谢组学表现出独有的特征，且能非常灵敏地反映细胞状态，有可能在肿瘤诊疗中发挥一定作用。二＞EV携带的代谢物作为肿瘤诊断标志物的价值（一）采用EV样本进行代谢组学标志物研究的优缺点与细胞培养液相比，血液及尿液等临床样本具有更大的异质性，但要想评价代谢物作为诊断标志物的价值，使用临床样本开展研究是非常必要的。体液样本和体液来源EV样本所富集的代谢物存在差异性［27］，目前代谢组学诊断标志物研究大多是直接采用体液样本进行分析，分离EV后再进行代谢组学研究的还相对较少。这2种研究方案各自有其优缺点。从临床应用的难易程度上讲，直接采用体液样本更加快速便捷，而提取EV进行分析，增加了前处理过程，提高了成本，因此临床应用难度较大。从诊断效能的优劣上来看，由于体液代谢物含量受饮食及化合物稳定性等多种因素的影响［28］,所以有囊泡膜保护的EV携带的代谢物可能是标志物研究的更好选择°EV是活细胞“主动分泌”的，其代谢物成分具有选择性，可能包含更丰富和特异的信息。此外，EV表面的许多特异性蛋白还能够用于分离肿瘤特异性的EV［29］。因此EV样本可能会提供更为同质化的代谢物来源，有利于富集肿瘤细胞的异常代谢改变，进而发现更加敏感和特异的代谢标志物。目前已有一些研究团队对体液代谢组学和体液来源EV代谢组学的诊断效能进行了比较［18，27，30］，例如Puhka等［30］发现，与尿液相比尿液EV样本中存在特异性富集的代谢物，且尿液EV携带的代谢物的肿瘤相关改变更加明显。但由于相关报道有限，且大多纳入的样本数量较少，因此直接使用体液样本和使用体液来源的EV样本究竟孰优孰劣还有待进一步的评价。(二)EV携带的代谢物在各系统肿瘤中的研究泌尿系统肿瘤：泌尿系统肿瘤的相关研究大多采用尿液样本，其中研究最多的是前列腺癌(prostatecancer，PCa)。脂质代谢物研究方面，一项研究分析了15例PCa患者和13名健康对照者尿液EV携带的代谢物，发现9种脂类的水平存在差异，其中磷脂酰丝氨酸18：1/18:1和乳糖神经酰胺d18：1/16：0的显著性最高，将这2种脂质与磷脂酰丝氨酸18:0/18：2进行组合，可达到93%的敏感度和1%的特异度［31］。另一项研究发现PCa患者尿液EV中磷脂酰甘油22：6/22：6明显较高，而甘油二酯16:0/16：0和16:1/18：1以及许多甘油三酯却明显较低［11］。而在其他小分子代谢物方面，有研究发现尿液来源EV携带的多种脂质和氨基酸在PCa和前列腺增生之间表现出明显丰度差异，且PCa患者尿液EV中硫酸脱氢表雄酮水平明显较高，这与PCa患者雄激素合成的潜在升高相一致［32］。此外还有一项研究同时对尿液EV和血小板EV的代谢组学特征进行了分析，结果发现与对照组相比，前列腺切除术前患者尿液EV样本中的葡萄糖醛酸、5-磷酸核糖和异丁基-1-肉碱水平明显较低。此外该研究还发现了在尿液EV样本中特异性富集的代谢物Y谷酰基半胱氨酸，它在血小板EV和尿液样本中均未富集，这一发现可能有助于推测EV的来源［30］。除前列腺癌外，也有研究者对肾癌中EV代谢组学的诊断价值作了探究，研究发现肾细胞癌患者尿EV携带的溶血磷脂酰乙醇胺丰度明显低于正常对照［16］。呼吸系统肿瘤：EV携带的代谢物在呼吸系统肿瘤中的相关研究主要围绕肺癌展开，2项研究分别使用了血浆和胸腔积液样本。第一项研究发现，血浆EV所携带的包含7种脂质在内的特定组合能够对非小细胞肺癌和健康对照进行区分，ROC曲线下面积(areaunderthecurve，AUC)可达0.80以上［33］；随后另一项研究对胸腔积液中的EV进行了代谢组学分析，发现1EV比sEV更能区分恶性胸腔积液，于是研究团队继续探究了胸腔积液1EV中一组代谢物(苯丙氨酸、亮氨酸、磷脂酰胆碱35：0和鞘磷脂44：3）对肺癌的诊断价值，其AUC可达0.95［34］。消化系统肿瘤：消化系统肿瘤研究主要采用的是血液样本°Zhu等［35］的研究证明了一组由3，-尿苷酸、棕榈油酸、棕榈醛和癸酸异丁酯组成的EV携带的代谢物可预测食管癌复发，其AUC可达0.98。另一项在胰腺癌中开展的研究发现胰腺癌患者与健康对照者血清EV中有多种脂质存在明显差异，进一步分析还发现溶血磷脂酰胆碱22：0、磷脂酰胆碱14：0/22:2和磷脂酰乙醇胺16:0/18：1与肿瘤分期、CA19-9、CA242和肿瘤直径有关，且磷脂酰乙醇胺16:0/18：1还与患者的总生存期呈负相关［36］。此外，还有研究发现高丰度的EV鞘氨酸、心、磷脂、溶血磷脂酰丝氨酸和1-羟基脂肪酸以及较少的硫酸盐和酰基葡萄糖谷甾醇酯与肝癌密切相关［37］。妇科肿瘤：一项乳腺癌相关研究收集了78例乳腺癌患者和30名健康对照者的1EV，利用靶向和非靶向质谱对其代谢组进行了表征，结果发现8种代谢物存的差异具有统计学意义，其联合诊断的AUC可达0.78。此外该研究还发现高浓度的溶血磷脂酰胆碱aC26：0和磷脂酰胆碱aaC38：5与乳腺癌较短的总生存期相关［15］。另外一项研究则是对完整的活细胞和组织中的EV直接进行了可视化和表征，结果发现乳腺癌组织内、组织边界和血管周围有大量的富集还原型烟酰胺腺嘌吟二核苷酸（磷酸）的EV，且其百分比与人类乳腺癌的诊断相关［38］。此外还有研究探索了血浆EV代谢组学在子宫内膜癌中的诊断价值，结果也提示患者与健康对照者的EV携带的代谢物水平存在差异［39］。其他肿瘤：有研究发现与健康人群来源的EV相比，从头颈鳞状细胞癌患者血浆分离的EV中富含嘌吟代谢产物，并携带较高水平的腺苷。该研究还发现早期疾病和无淋巴结转移患者的EV中腺苷和5，鸟苷酸水平较高，而在晚期和淋巴结受累的患者中嘌吟代谢产物水平较低［21］,这一发现提示转移活性较强的患者肿瘤细胞代谢活动可能发生了改变，具有重要意义。此外，黑色素瘤患者的血清源EV代谢组学与健康对照组相比具有显著差异，其中磷脂酰胆碱16：0/0：0在黑色素瘤患者血清和黑色素瘤干细胞来源的EV中含量较低［26］。综上，EV代谢组学能够灵敏和特异的反映肿瘤状态，在肿瘤诊断方面具有重要意义。三、EV携带的代谢物调控肿瘤进展的功能促进囊泡摄取：EV可以通过多种不同的途径与靶细胞相互作用，代谢物尤其是脂质在这个过程中也发挥着非常重要的作用。一方面EV可以借助膜上的生物活性脂质与靶细胞表面的受体相互作用直接影响其生命活动［40,41］。另一方面EV还能通过被受体细胞摄取进而发挥作用［42］，目前有研究发现某些肿瘤来源的EV表面存在着如PS［43,44］、溶血磷脂酰胆碱［45,46］等标记，并且富含脂筏相关的脂质，能够促进EV被靶细胞摄取。提供代谢原料：有多项研究发现，EV携带的代谢物能够作为原料被靶细胞摄取，调控肿瘤细胞的生命活动。例如一项研究发现肿瘤相关纤维母细胞来源EV能够以类似于巨胞饮的方式被营养匮乏的肿瘤细胞摄取，向其提供氨基酸等代谢物，抑制细胞氧化磷酸化并增强糖酵解和谷氨酰胺代谢，进而促进肿瘤的增殖［47］。与之类似，人间充质干细胞EV中也发现了谷氨酸和乳酸的富集［48］。此外，还有研究发现脂肪细胞来源的EV能够通过转移脂肪酸促进黑色素瘤细胞的脂肪酸氧化，且这种变化可能还会诱导线粒体重新分配到细胞末端，进而促进肿瘤细胞的迁移［49］。参与细胞通讯：除了提供肿瘤细胞所需的代谢原料，EV所携带的代谢物也可能作为活性物质发挥作用。有研究发现胰腺癌细胞来源的EV能够通过递送脂质抑制Notch-1通路进而诱导细胞凋亡［50］。Yin等［51］的研究则发现肿瘤源性EV携带的脂肪酸能够通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体，诱导代谢向氧化磷酸化方向转移，从而导致树突细胞免疫功能障碍。Xiang等［52］的研究也发现小鼠乳腺癌细胞来源EV携带的生物活性脂质如白三烯和前列腺素，可促进癌症骨髓细胞向髓系抑制细胞方向分化，进而诱导免疫抑制。另有研究者发现高转移性乳腺癌的EV与低转移性细胞相比，存在不饱和二酰基甘油的富集，富含这种脂质的EV能够激活内皮细胞蛋白激酶D信号通路，刺激血管生成［9］。此外，Sagar等［53］还发现胰腺癌细胞来源的EV能够通过传递肾上腺髓质素促进脂肪分解，从而引起副肿瘤效应。综上，EV携带的代谢物可以通过促进囊泡的摄取及作为底物或活性物质的方式调控肿瘤细胞及基质细胞的功能，在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。四、讨论与展望组学研究是当前生命科学领域的热点，其中基因组能够预测未来会发生什么，转录组和蛋白组能够告诉我们可能发生什么，而代谢组能够让我们知道正在或已经发生了什么。上游组学能够引起代谢组学的改变，反过来小分子代谢物也会对上游产生一定影响。相比之下，代谢组学能够更加直接和敏感地反映机体和细胞的状态，它作为EV组学研究中的重要组成部分，目前却研究甚少。但随着研究的不断深入，人们发现小分子代谢产物也可以通过EV转移到肿瘤细胞或肿瘤微环境的基质细胞中，影响受体细胞的生命活动［47，49，51,52,53］（图1），此外特异性富集的EV代谢货物还可能用于判断EV的来源［30］并作为肿瘤诊断标志物［15,31，33,34,35］。然而，这一新兴领域面临着诸多挑战，未来还有大量工作有待开展。1.在标志物研究方面：（1）代谢组学标志物研究既可以直接使用体液样本，也可以使用体液来源的EV样本，但是哪种方法的诊断效能更高，还缺乏相关研究的验证；（2）由于许多分析前因素都会对EV代谢组学研究产生影响，所以EV代谢组学相比其他组学研究应对EV纯度有更高的要求，尤其是容