发酵培养基的制备和实罐灭菌

发酵培养基的制备和实罐灭菌一、实验目的要求学生掌握通风发酵的基本原理及过程，掌握上罐操作技术，掌握流加补料控制技术。（1）发酵罐及管路、空气过滤器灭菌操作及发酵罐系统管路的熟悉（2）实罐灭菌—培养基灭菌实验二、实验原理2.1培养基组分的种类和作用：人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物的营养物质。主要包括：碳源、氮源、无机盐、生长因子、前体2.2实罐灭菌原理保温保温温度（℃）加热保温冷却温度（℃）时间（min）三、实验仪器、设备和材料10升发酵罐（PH仪，培养液及酸碱液流加装置，蠕动泵），1台；淀粉水解糖液、尿素等原料。四、实验内容与方法：酵母菌经扩大培养后，接入10升机械搅拌通风发酵罐培养，根据实际情况选用分批培养或分批补料培养，测定酵母浓度。主要内容有：试管斜面培养基的配制、面包酵母种子扩大培养基配制、流加用培养基的配制及灭菌。总流程：斜面培养基配制与灭菌所需仪器物品：灭菌锅、试管、棉塞、培养基原料、培养箱300毫升种子液、500ml三角瓶三只、装液100ml、培养基、培养摇瓶、纱布。发酵培养基制备，灭菌。面包酵母菌的培养基组成：酵母斜面培养基：10º麦芽汁固体斜面，PH5.0酵母摇瓶培养基：10º麦芽汁，PH5.0或葡萄糖10%，玉米浆1%，尿素0.2%，PH5.0酵母分批发酵培养基：玉米淀粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓度为10%、玉米浆1%，尿素0.2%，PH5.5。五、实验报告内容和数据处理实验设计原理；发酵系统的结构与操作方法；实罐灭菌工艺。附：机械搅拌发酵系统介绍：1技术指标1.1概述具有温度、转速、氧气流量、空气流量、pH、DO、补料、消泡显示及控制功能，并配有机械消泡浆。1.2指标1.2.1温度：自动控制范围：自来水温+5℃～50℃﹙±0.2℃﹚显示范围：1.2.2搅拌转速：调速范围50～1000±5rpm1.2.3空气流量：显示控制范围0～10L/min1.2.4pH显示控制：2～12pH±0.05﹙酸碱双向﹚1.2.5溶解氧：0～150±2℅1.2.6补料、消泡蠕动泵各一台1.2.7罐体总容积10L,设计压力2.0kg/c㎡、最高工作压力2.0kg/c㎡,设计工作温度1311.2.8灭菌方法:手动控制蒸汽消毒灭菌1.2.9功率：主机：3kw,单相220v1.2.10气源：2～4kg/c㎡1.2.11蒸汽：2～4kg/c㎡2管路说明该流程图中空气管路阀门的标号为“AXX”,蒸汽管路阀门的标号为“SXX”，冷却水管路阀门标号为“WXX”，冷凝水管路阀门标号为“VXX”，电磁阀标号为“CXX”，物料管路阀门标号为“PXX”,冷冻水管路标号为“CWX”，其它气体管路标号为“NXX”。2.1空气及其净化来自空气压缩机的压缩空气经净化器（外接减压稳定器、除水、除尘、空气予过滤器）进入发酵罐空气总管，空气流量计针阀A01、阀A02、单向阀、空气过滤器，阀A03到达反应器内，尾气经阀VT1排出，本管路具有计量，净化作用。注：空气流量显示的流量是以过滤器前的压力下的流量，不是标准状态下的流量。2.2蒸汽2.2.1蒸汽进夹套蒸汽经阀S01进入夹套（上进），经阀V01排出冷凝水。蒸汽对培养基预热。2.2.2蒸气进反应器蒸汽经阀S02、单向阀、空气过滤器、阀A03进入罐内，由排气口控制阀VT1排出。蒸汽对过滤器及空气管线消毒。2.2.3蒸汽进取样阀及放料阀蒸汽经阀S03进入取样阀，出阀P02排出冷凝水。2.3自来水2.3.1自来水进夹套当电磁阀C01打开时，自来水经自动注水阀、阀W01进入发应器夹套（下进），由夹套上口、阀W02、加热器、电磁阀C01排出；当电磁阀关闭时，夹套水经W02进入电加热器、循环泵、单向阀进入夹套（下口），通过夹水套水的循环，将加热器的热能带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。特别提示：温度自动前必须对夹套注水。2.3.2自来水进排气冷凝器自来水经阀W03进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却尽可能减少培养基的水分蒸发2.4冷却水（选配）（消毒后降温应优先使用自来水）冷冻水经电磁阀C02进入加热器内盘管，对夹套循环水进行冷却。冷冻水经切换阀T02（关T01）进入自来水管线、经切换阀T04（关T03)返回冷冻水回路。2.5纯氧管线（选配）纯氧管线：纯氧进入流量计、电磁阀C03、切断阀A21进入空气过滤器。纯氧流量调节：开C03、A21后调节流量计的调节手柄。2.6空气流量检测与控制：空气热质量流量计：与空气玻璃转子流量计并联安装且在热质量流量计前后安装切断阀。热质量流量计内通道必须保持干燥无尘，因此只有在发酵过程中才开质量流量计的前后切断阀A11、A12，发酵结束后应及时关闭A11、A12。（详细说明见热质量流量计的说明书）2.7补氨水管线氨水经电磁阀C04、切断阀A31、补料针进入发酵罐，电磁阀由控制器控制。

3实罐灭菌操作3.1准备3.1.1盖紧罐盖上各种罐盖，旋紧罐盖上压紧螺栓。3.1.2标定pH、DO电极，将电极插入罐体侧面的传感器口并及时地锁紧螺母，确保安装妥当防止高压下传感器弹出伤人。3.1.3关紧发酵罐底阀P01，倒入培养基，调整PH值，旋紧接种口注：氯离子对不锈钢会带来不可逆转的破坏，因此应避免用盐酸溶液调节PH，如工艺上无法避免用盐酸，应控制盐酸浓度不大于5℅且在添加过程中不得直接接触不锈钢。3.1.4关排气冷凝器进水W03，移去进出口的软管排尽冷凝水夹套中水3.1.5提起过滤器使过滤器后的三通阀A03处于“S”位置。（S—消毒，F—发酵），3.2培养基预热3.2.1准备工作预热启动蒸汽发生器及空气压缩机。将控制器中的温度控制设定为手动。开排气阀VT1，关闭其它所有阀门。3.2.2开排气阀VT1，开夹套冷凝水阀V01排夹套水，关闭其它阀门3.2.3启动反应器搅拌马达。调转速200～300Rpm3.2.4蒸汽进夹套：缓缓开夹套蒸汽阀S01蒸汽进夹套（注意：此时有轻微爆破声属正常，如声音过响则开阀的速度应减慢）。待排水总口排出蒸汽时调节冷凝水阀V01，控制蒸气排出量以有少量蒸汽排出即可。并控制夹套内压力不超过0.2Mpa。当培养基预热至98℃时，进入实罐灭菌操作，在培养基温度在80～903.2.5蒸汽进取样阀：开出料阀P02（关紧底阀P01），开蒸汽阀S03，蒸气进入取样阀内腔，当阀P02排尽冷凝水后应调节其开度，以少量蒸汽排出即可。3.3实罐灭菌3.3.1过滤器消毒：（A或B任选一种，首次消毒或每五批用“A”种消毒，其余可用“B”种消毒）A：外源蒸汽消过滤器：微开过滤器上排冷凝水阀V02、V12，开过滤器前蒸汽阀S02，蒸汽经过滤器进入反应器，当冷凝水阀V02、V12出口冷凝水很少时，调节冷凝水阀以有少量蒸汽排出为宜。当排气口有蒸汽排出或罐温达到100℃两分钟后，关闭排气阀VT1。调节蒸汽阀S02，维持过滤器前蒸汽压为0.12～0.16Mpa。当罐温达到100B：罐内蒸汽消过滤器：过滤器三通阀处于“S”位置。停搅拌，微开过滤器上排冷凝水阀V02、V12，当有罐压时，罐内蒸汽经空气管罐内三通阀进入过滤器，进V02、V12排出冷凝水。当排气口有蒸汽排出或罐温达到100℃两分钟后，关闭排气阀VT1。调节冷凝水阀V02、V12以有少量蒸汽排出为宜。当罐温达到100℃3.3.2当达到预定温度或罐压，开排气阀VT1至有少量蒸汽排出，关紧或微开夹套蒸汽阀S01，微开罐底阀P01（开阀时观察视镜处培养基翻动的变化，以有少量的变化为亦），根据罐压或罐温变化的趋势，及时调整蒸汽阀S02、S03。阀门调节宜微调应避免大幅度开关。当反应器罐压或罐温维持在预定的范围内开始计时。3.3.3保温开始后，排气阀蒸气排量不宜太小，否则可能导致液面以上的罐体部分尤其罐盖达不到消毒温度。3.3.4保温阶段应旋松接种口盖至有少量蒸气冒出。3.3.5移种管线消毒（适用于多级发酵）：在保温过程中开移种管线阀P03及受种阀前排水阀V04，保温结束前关V03。3.4灭菌完成及降温（先开后关，后开先关）3.4.1保温结束首先旋紧接种口盖.旋紧罐底阀P01，再关紧取样器的蒸汽阀S03。抬起过滤器使三通阀A03处于S位置，关紧蒸汽阀S02，调节过滤器冷凝水阀以有微量排气为宜。3.4.2关夹套蒸汽阀S01、冷凝水阀V01，开夹套进水阀W01和循环管线切断阀W02.在控制器中将温度控制方式设定为“自动”并对温度进行设定，发酵罐进入自动降温。按下搅拌开关，设定搅拌转速并“自动”控制。3.4.3当罐压接近0.05Mpa时关阀V02，缓缓开空气管线A01、A