【Syx】重组DNA技术的基本工具课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第1节重组DNA技术的基本工具1.什么叫基因工程？P65基因工程的原理是什么？基因工程有什么优点？基因工程的发展？2.重组DNA技术的用到的基本工具是哪三个？3.限制酶的主要从哪类生物中分离纯化出来的？切割的化学键是？4.EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶切割DNA后，分别产生什么样的末端？5.DNA连接酶的作用？作用的化学键？6.E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶分别来自什么生物？它们连接的末端有什么差异？7.基因工程中用的载体起什么作用？作为载体要具备哪些条件？种类有哪些？8.质粒的化学本质是什么？只有原核生物才有质粒吗9.限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的作用分别是什么？10.DNA粗提取的原理？11.DNA和蛋白质在酒精中溶解性有什么差异？12.DNA在NaCl溶液中溶解度与NaCl溶液的浓度存在怎样的关系？13.鉴定DNA的原理？（条件？试剂？现象？）第三章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具

背景资料1

我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身能抵抗棉铃虫的棉花就能解决这个问题。

普通棉花不抗虫，苏云芽孢杆菌可以合成抗虫毒素——Bt毒蛋白，请思考如何生产抗虫棉？杂交育种？诱变育种？等技术能否实现？为什么？杂交育种：同种生物之间进行；诱变育种：在原有基因基础上发生基因突变，结果产生新的等位基因（不定向）克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物性状基因工程一思考：能否将苏云金杆菌的“抗虫基因”导入棉花细胞，使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？

就是按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。1.原理：2.操作水平：3.结果：分子水平基因重组赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品工具工具酶分子运输车：

。（１）

。（２）

。限制酶ＤＮＡ连接酶载体【易错警示】工具酶≠工具质粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒“手术刀”“缝合针”重组DNA技术的基本工具限制性内切核酸酶——“分子手术刀”二

1、来源：主要从原核生物中分离纯化来的

2、种类：数千种

【P71旁栏思考题】限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、起防御作用。

原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。

【P74拓展应用1】为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？限制性内切核酸酶——“分子手术刀”二

1、来源：主要从原核生物中分离纯化来的

2、种类：数千种3、特点:能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。

识别序列有何特点？大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数4个、8个或其他数量均有中心轴线，且中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向重复排列，即回文序列。中心轴线EcoRⅠSamⅠ4、限制酶切割结果:产生黏性末端和平末端EcoRⅠ限制酶

SmaⅠ限制酶DNA连接酶——“分子缝合针”三磷酸二酯键什么样的末端才能连接起来？教材P74课后题拓展应用2：有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？XbaⅠ因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）DNA连接酶——“分子缝合针”三磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端黏性末端根据所学知识，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶ba1.切断a处的酶为_______

2.连接a处的酶为_______3.切断b处的酶为_______①③④②a：磷酸二酯键；b：氢键解旋酶DNA复制时断：DNA酶

限制酶

能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。连：DNA聚合酶只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上

DNA连接酶只能催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键问题三：如何目的基因运送到细胞呢？基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”四任务：分析归纳载体需要具备的条件：问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。条件④：载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害。载体种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，具有自我复制能力的环状双链DNA分子。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。思考：若想要利用质粒将人的胰岛素基因导入大肠杆菌需要进行哪些操作才能形成含有目的基因的质粒？

首先用一定的限制酶切割质粒，使它出现一个切口；然后用同种限制酶（或能产生相同末端的限制酶）切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到质粒切口处突破：用限制酶切割时需注意的事项①获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是

。但是使用该法缺点是容易发生

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。②获取一个目的基因需限制酶切割

次,共产生

个游离的磷酸基团。为了产生相同的黏性末端，便于连接两4分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接限制酶切质粒DNA连接酶连接连接产物如何表示？重组质粒GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG目的基因、质粒自身环化目的基因与质粒反向连接例2.如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线

用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是

（从“EcoRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是：

。

BamHⅠ/HindⅢ若选EcoRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。延伸应用图解限制酶的选择原则如何将DNA提取出来，并进行鉴定呢?DNA的粗提取与鉴定探究和实践一、实验原理1.提取DNA的原理利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，对它们进行提取。(1)DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于

的NaCl溶液。2mol/L2.鉴定DNA的原理在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺（现配现用）试剂会呈现蓝色。DNA的粗提取与鉴定探究和实践二、目的要求：1.了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。2.学会DNA粗提取的方法以及利用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。三、材料用具：1.材料：哺乳动物成熟的红细胞洋葱花菜香蕉猪肝鸡血菠菜DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。四、操作过程：1.在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作错误的是()A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B.用限制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同D.质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞E.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA连接酶连接的重组DNA还能用上面两种酶切割DE2.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是()a酶切割产物(bp)b酶再次切割产物(bp)1600；1100；300800；300A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接C.a酶与b酶切断的化学键不相同D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，D序列会明显增多例1.下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是（）注：Y为C或T，