酵母单、双杂交PPT

酵母单、双杂交技术目录CONTENTS酵母单杂交技术2膜系统酵母双杂交技术3赛尔生物酵母单、双杂交技术服务5酵母单、双杂交在医学领域的应用4核系统酵母双杂交技术11酵母双杂交--基于GAL4的双杂交核系统Part

酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，用来研究活细胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也适用于高等植物蛋白质之间相互作用的研究。核系统酵母双杂交功能鉴定两个蛋白之间的相互作用发现新的与已知蛋白互作的蛋白确定蛋白相互作用的区域核系统酵母双杂交初识MATa型，筛选标记为：trp1，leu2报告基因为：AbAr，HIS3，ADE2，

MEL1由一些营养选择标记HIS3和(或)编码酶的基因IacZ基因组成，能显示“诱饵’和“猎物”相互作用的基因pGBKT7：筛选标志为Trp1，用于表达DNA-BD与Bait)的融合蛋白pGADT7：筛选标志为Leu，用于表达DNA-AD与Prey的融合蛋白MATα型，筛选标记为：trp1，leu2报告基因为：lacZ（对ß-gal显阳性）

MEL1（对α-gal显阳性）Y187菌株Y2HGold菌株报告基因配套质粒核系统酵母双杂交报告株

报告株指经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。

最常用的是酵母细胞,其作为报告株的酵母双杂交统具有许多优点：易于转化、便于回收扩增质粒具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合改造后的酵母细胞的特点:基因组中GAL4是缺失型的基因组中引入额外的报告基因Leu、Trp、His核系统酵母双杂交常用结构域DNA-BDYTH常用：

GAL4系统DNA-AD真核细胞：GAL4系统(具有核定位序列)原核细胞：LexA系统(不具有核定位序列)GAL4、VP16、B42核系统酵母双杂交原理PromoterlacZ(orHIS)reportergeneGALUASTranscriptionDNA-BDDNA-ADBaitPreyDNA-BDDNA-ADDNA-BDBaitDNA-ADPrey文库构建流程＋＋dscDNAY187SD/-Leu筛选cDNA文库的评价及鉴定文库分装及冻存cDNA文库扩增目的基因合成目的片段与载体的连接大肠杆菌感受态的制备诱饵质粒构建流程诱饵质粒毒性及自激活验证菌液PCR鉴定核定位检测互作蛋白筛选流程1ml

文库菌4ml诱饵菌混合培养杂交融合-二倍体筛选回转验证

在细胞裂解物中，加入结合在固相支持物上的某种特异性抗体共孵育，该抗体就能够与其抗原形成免疫复合物。被抗体沉淀下来的靶抗原又在裂解液中共沉淀了一种结合伴侣蛋白。那些不能被沉淀下来的蛋白就会被洗涤走。然后进行SDS和Westernblot分析。在co-IP中，当相关蛋白能够被共沉淀下来时通常假定这些蛋白在细胞水平上与靶蛋白的功能相关。免疫共沉淀的原理细胞裂解液与结合在固相支持物上的抗体共孵育互作蛋白CO-IP验证目的基因引物模板--回转验证阳性克隆质粒扩增目的基因pGBKT7-Myc-BaitpCDNA3.1-HA-Prey共转染CO-IP验证上拉下拉2酵母单杂交技术Part

酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白质之间的相互作用，以研究真核细胞内的表达调控。酵母单杂交基本原理在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGla4结合位点。该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gla4的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。酵母单杂交基本原理诱饵（Bait）--DNA目的片段，或者一段诱饵序列，通过单拷贝或者随即拷贝克隆到pAbAi载体上，构建好的pBait-AbAi载体通过同源重组可高效整合到Y1HGold酵母菌株中，并产生诱饵特异性报告菌株。

猎物(Prey)—猎物蛋白，被融合到含有酵母GAL4转录激活结构域（GAL4AD）表达载体中进行表达，通过共转化SMARTPCR扩增的cDNA和线性化pGADT7-Rec载体到酵母Y1HGold诱饵报告菌株中可以直接构建好酵母中的猎物文库。酵母单杂交原理将一至三个目的DNA重复序列克隆至pAbAi报告载体，然后整合到Y1HGold酵母基因组中以构建一个诱饵特异的菌株，一旦文库中的猎物蛋白质与诱饵序列相结合，就会激活AbA抗性（AbAr）基因的表达，从而能够在含有抗生素AbA的培养基上生长。目的基因合成目的片段与载体的连接pBait-AbAi构建流程PCR鉴定诱饵质粒转入酵母菌Y1HGold检测诱饵菌株AbA’基因的表达目的确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA最低浓度文库构建及筛选流程＋＋dscDNAY1HGold[Bait/AbAi]cDNA融合表达文库的筛选阳性克隆的鉴定及cDNA质粒的分离鉴别阳性及假阳性互作，阳性克隆测序分析3酵母双杂交--Sos蛋白介导的双杂交膜系统Part

Sos蛋白介导的双杂交膜系统是把蛋白质相互作用的场所从核内转移到酵母的细胞膜上，通过应用2个蛋白质相互作用后对Ras信号通路的恢复作用而取代传统的转录激活机制，克服了传统双杂交系统的一些局限性。膜系统酵母双杂交初识pSos：筛选标志为Leu，用于构建诱饵质粒pMyr：筛选标志为Ura，编码十四烷基化膜定位

信号(Myr)，加入galactose可诱导表达MATα型，

其基因的1328位氨基酸残基发生点突变，编码脒基核苷酸交换因子，该因子结合并激活Ras，启动RaS信号传导途径生长温度：25℃可以生长，37℃不可以生长CdC25H菌株配套质粒Sos蛋白介导的双杂交系统原理人类Sos蛋白和所研究的基因融合而成诱饵蛋白。靶蛋白上连有一个十四烷基化（Myristylation）膜定位信号，它使靶蛋白锚定到细胞膜上。诱饵和靶蛋白的相互作用使人类Sos蛋白在酵母细胞膜上定位，从而激活Ras信号转导级联反应（cascade）。将诱饵蛋白克隆到pSos载体中，可表达产生hSos和诱饵蛋白的融合蛋白靶蛋白基因与pMyr载体相连接表达产生的融合蛋白可以将其固定在细胞膜上将文库和诱饵质粒共转化到酵母感受态中诱饵蛋白与靶蛋白融合表达如果靶蛋白和诱饵蛋白相互作用，则hSos蛋白即可固定于细胞膜上，hSos蛋白激活Ras信号转导途径酵母能够在37℃

生长酵母双杂交系统的实现过程确定酵母菌表型营养缺陷型筛选酵母菌株标志性表型的鉴定接种于YPDA培养基，25℃有菌生长，37℃无菌生长Trp(-)、Leu(-)、His(-)、Ura(-)不能生长，在YPDA上可以生长检测回复突变文库构建流程＋dscDNA连接并转化XL1-blue感受态细菌cDNA文库的评价及鉴定文库分装及冻存cDNA文库的扩增Amp抗性阳性克隆挑选目的基因合成目的片段与载体的连接诱饵质粒构建流程诱饵质粒自激活及细胞质定位检测重组鉴定重组质粒纯化自激活检测（排除bait蛋白可与myristlyationsignal结合）细胞质定位检测（用于验证Sos-bait融合蛋白可以正确定位于胞浆中）诱饵蛋白表达WB验证互作蛋白筛选流程0.1ml

文库菌1ml诱饵质粒菌杂交融合筛选回转验证阳性克隆挑选和验证酵母转化细胞SD/glu(–UL)SD/gala(–UL)SD/glu(–UL)SD/gala(–UL)25℃37℃阳性对照++-+阴性对照++--克隆++-+再次验证37℃培养SD/glu(–UL)和SD/gala(–UL)重复验证阳性克隆质粒与诱饵质粒共转免疫共沉淀验证其相互作用

从抽提出的pMyr质粒上，将插入片段亚克隆到真核表达载体pCD3cmyc上，用小提纯化试剂盒纯化质粒，转染HEK293细胞。用鼠抗cmyc抗体作为一抗进行westernblot。4酵母单、双杂交在生物医学领域的应用Part酵母单杂交在生物医学领域的应用1、确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。2、分离编码结合于目的顺式作用元件或其他短DNA结合位点的新基因。3、定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。酵母双杂交在生物医学领域的应用

通过细胞内一系列蛋白质间的相互作用或蛋白质与其它分子间的相互作用完成的病毒学研究

可以筛选和病毒相互作用的宿主蛋白，验证已知蛋白之间的相互作用，揭示病毒的生理过程蛋白质组研究药物研究细胞信号传导研究

筛选不同受体、蛋白激酶、磷酸化酶、细胞骨架蛋白以及参与细胞周期调控和肿瘤发生的蛋白质等

筛选与来源于肿瘤、细菌及病毒的蛋白间相互作用的多肽类药物，确定药物互作蛋白在肿瘤、细菌及病毒中的位置，有目标性地干扰疾病蛋白的表达5赛尔生物酵母单、双杂交技术服务Part酵母单、双杂交验证实验2143