实验一 细菌的革兰氏染色

实验一细菌的革兰氏染色日期10月27号星期三90节一实验目的1学习显微镜油镜的使用方法2学习微生物的无菌操作技术3学习细菌的革兰氏染色法二实验原理1显微镜及油镜物镜的使用原理1)油镜头的标志油镜头上常刻有OI（oilimmersion）或HI（homogeousimmersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记。在低倍物镜、高被物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numericalaperture）最大，而工作距离最短。2)显微镜的分辨率显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它的分辨率的大小。分瓣率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比：D=λ/2NA从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积：NA=n×Sinα/2影响数值孔径大小的因素－是镜口角，二倍介质的折射率。当物镜与玻片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.0）与玻璃（n=1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃的相近，光线经过玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。2细菌的革兰氏染色原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类.G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。三实验器材1菌种：培养24h的枯草杆菌（Bacillcussubtilis）、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。2染色液和试剂：生理盐水、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液,香柏油，显微镜擦拭液.３器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。四实验方法1涂片:取一干净载玻片,中央滴一小滴生理盐水,无菌操作取菌无菌操作(快):在酒精灯上灼烧接种环(注意手势)---松动试管帽---取下试管帽---灼烧管口---在火焰旁接种环通过火焰进入菌种管---接种环在管壁冷却---挑取菌少许---退出---灼烧管口---盖帽---涂片(调匀涂成薄膜)---灼烧接种环.2干燥:室温自然凉干3固定:手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）.4染色:初染(加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,自来水水洗)---媒染(加碘液冲去残水,并覆盖一分钟,水洗)---脱色(将水甩净,衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出的酒精不出现紫色时为止,约20-30秒,立即用水冲净酒精)---复染(用蕃红液染2-3分钟,水洗)5干燥:室温凉干或吹风机吹干6镜检:先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，油观察细菌的形态。五实验现象1枯草杆菌革兰氏阳性杆菌，杆形，不规则排列，紫色2金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌，圆球形，不规则排列，紫色3大肠杆菌革兰氏阴性杆菌，杆形，不规则排列，红色六实验结果及思考题１用油镜观察时玻片为什么要完全凉干?答：当玻片未完全晾干时，残留的水会使折射率增大，使景象模糊。２叙述无菌操作时应注意的问题。答：接种环在接种前后都需灼烧，试管盖不可随处放置，取菌株时需穿过火焰。３绘出所观察细菌的菌体形态并注明革兰氏染色反应阳性和阴性。4革兰氏染色成败的关键是什么?答：染色时间