现代分离与测试技术课件

現代分離與測試技術

傳統（經典）提取分離技術溶劑提取法（浸漬、滲漉、煎煮、回流等）水蒸汽蒸餾法溶劑分離法分餾法沉澱法昇華法結晶法傳統結構測試技術理化性質測定波譜數據化學降解化學轉換半合成全合成文獻比較現代分離技術色譜技術

吸附、分配、離子交換、分子篩、親和色譜等類型低壓快速、逆流液滴分溶（DCCC）、高效液相（HPLC）等分子蒸餾超臨界萃取膜分離毛細管電泳現代測試技術核磁共振（NMR）2D-NMR質譜（MS）HRMS

紅外（IR）紫外（UV）旋光（ORD）X射線單晶衍射（X-RayCrystalAnalysis）嗎啡（morphine）的研究1804-1806年發現1925年提出確定結構1952年人工全合成合計約150年從發現、確定結構，到人工全合成，僅花4年時間（1952－1956）利血平（reserpine）的研究分離測試聯用技術氣質聯用液質聯用(LC-MS)液核聯用(LC-NMR)主要內容1.提取分離前的準備工作2.一般原理及常用方法3.活性成分的分離方法4.注意事項1.提取分離前的準備工作1.1考察研究材料的學名、產地、藥用部位、採集時間與方法等1.2文獻調研，以瞭解利用前人經驗1.3化學成分預試實驗1.4確定提取分離方案2.一般原理及常用方法2.1提取溶劑法、水蒸汽蒸餾法、昇華法等2.2分離

2.2.1根據物質溶解度2.2.2根據物質在兩相溶劑中的分配比2.2.3根據物質的吸附性2.2.4根據物質分子大小2.2.5根據物質解離程度2.2.1根據物質溶解度差別改變溫度：結晶、重結晶改變極性：沉澱多糖、蛋白質等改變pH值：酸堿法分離生物鹼、黃酮，等電點分離氨基酸等加入沉澱劑2.2.2根據物質在溶劑中的分配比液液萃取分配係數：K=CU/CL分離因數：

=KA/KB

>50逆流分溶：

<50液液分配柱色譜正相色譜與反相色譜加壓液相柱色譜液滴逆流色譜（DCCC）及高速逆流色譜（HSCCC）

2.2.3根據物質的吸附性差別固－液吸附、物理吸附和化學吸附吸附規律：相似者易於吸附（吸附劑、溶質、溶劑）簡單吸附法進行物質的濃縮與精製吸附柱色譜用於物質的分離矽膠、氧化鋁、聚醯胺、大孔吸附樹脂等分離材料2.2.4根據物質分子大小差別透析法凝膠法

原理種類：葡聚糖凝膠（Sephadex）和羥丙基葡聚糖凝膠（SephadexLH-20）超濾法超速離心法離子交換法電泳技術2.2.5根據物質解離程度不同3.活性成分的分離方法分離得到純品後再進行活性測試

分離與活性測試分為兩個階段，結果易判斷，但盲目性大，活性成分易丟失（微量成分）活性指導法進行分離

選用簡易、靈敏、可靠的活性測試方法作指導，對分離進行活性評估，追蹤活性部分和活性成分。能有效地指導分離，排除干擾，調整方案，得到活性成分，但需具備分離和活性測試的知識、設備、經費等。主要內容結構測試的策略結構測試的步驟和技術應用舉例注意事項結構測試的策略文獻調研判斷化合物類型波譜學等技術進行測試

分子式、官能團、結構片斷、基本骨架、平面結構和立體結構等

結構測試的步驟和技術鑒定化合物的純度初步推斷化合物的類型測定分子式並計算不飽和度確定官能團、結構片斷和基本骨架確定平面結構確定立體結構鑒定化合物的純度熔點法TLC、PPC法GC、HPLC法初步推斷化合物的類型提取分離過程中的行為有關理化性質結合文獻測定分子式並計算不飽和度元素定量分析和分子量測定法同位素峰度法高分辨質譜法（HI-MS）不飽和度計算U=Ⅳ-Ⅰ/2+Ⅲ/2+1

確定官能團、結構片斷和基本骨架官能團定性及定量相關波譜學測定及解析UVIRMS1HNMR13CNMR確定平面結構提出一個或幾個可能結構綜合分析波譜測試結果結合文獻調研比較已知化合物或化學溝通（化學降解、衍生物製備或化學合成）確定立體結構測定CD或ORD測定NOE或NOESYX－射線單晶衍射人工合成應用舉例灰毛漿果楝D（cipadesinsD,24）的結構鑒定HRESIMS確定灰毛漿果楝D的分子式calcdforC33H40Na1O13[M+Na]+,667.2361

IR顯示羰基信號

IR吸收峰νmax1749、1738cm-1

灰毛漿果楝D的UV譜圖

灰毛漿果楝D的1HNMR譜圖

1個β取代的呋喃環4個與季碳相連的甲基3個乙醯基1個甲氧基灰毛漿果楝D的13CNMR譜圖

顯示33個信號，除1個甲氧基、3個乙醯基外，剩餘26個信號，包括1個β取代的呋喃環和4個與季碳相連的甲基，表明24可能為四降三萜類化合物灰毛漿果楝D的HSQC譜圖

灰毛漿果楝D的HMBC譜圖

HMBC實驗推定灰毛漿果楝D的結構ImportantHMBCcorrelationsofcipadesinsD灰毛漿果楝D的NOESY譜圖

NOESY實驗確定灰毛漿果楝D的相對構型ImportantNOESYcorrelationsofcipadesinsDX-射線單晶衍射實驗證明結構ORTEPdiagramof24主要內容概述儀器及其基本原理質譜解析應用概述質譜法（MassSpectrometry,MS）

化合物

離子化品質分析器檢測器特點：

範圍寬、靈敏度高、速度快、資訊直觀、確定分子量和分子式儀器及其基本原理質譜儀器離子源及離子化技術品質分析器及品質分離原理進樣系統離子檢測器TheMassSpectrometer

SampleinletIonsourceMassanalyzerDatasystemdetector離子源及離子化技術離子源離子化技術1.Electronimpactionization(EI)：2.Chemicalionization(CI)3.Fielddesorptionionization(FD)4.Fastatombombardmentionization(FAB)5.Matrixassistedlaserdesorptionionization(MALDI)6.Atmosphericpressureionization(API)(1).Electrosprayionization(ESI)(2).Atmosphericpressurechemicalionization(APCI)不同樣品所適用的離子化技術常規樣品採取EI法為提高分子離子峰豐度採用CI或FD法難揮發、高極性或分子量大的樣品，可採用FAB、MALDI和ESI法等質譜解析質譜中的離子質譜裂解規律質譜解析質譜中的離子MolecularionsFragmentionsIsotopicionsMultiplyionsMetastableionsOddelectronionsEvenelectronions分子離子的識別分子離子峰的強弱取決於分子離子的穩定性N規則合理的中性丟失改變試驗條件採用其他離子化方法分子離子的作用給出分子量給出分子式推測化合物的結構類型分子離子峰的相對豐度與分子的結構有關。FormulaC6H12C5H8OC4H8N2Mass84.093984.057584.0688質譜裂解規律裂解的產生：70eV、內部不安定因素電離發生的位置：最低電離電位的電子影響離子豐度的因素：

穩定性、stevenson規則、最大烷基丟失裂解方式：均裂、異裂和半異裂開裂的類型及簡單機理：

單純、重排和複雜開裂質譜解析參考被測樣品的其他已知資訊所用離子化方法確定分子離子確定分子式推測可能含有的官能團分析基峰及主要碎片離子可能代表的結構單元推測、篩選可能的結構式應用質譜在天然產物分析中的應用質譜在生命科學研究中的應用在天然產物分析中的應用電離方式相關技術超微量樣品離子化相關技術現場樣品前處理質譜聯用技術電離方式相關技術LC／APCI－MS測定了綠茶和紅茶中的12種微量兒茶酚檢測分析蔬菜汁中多種弱極性分子β胡蘿蔔素異構體ESI-multi-CHEFSORI-CIDFTMS)法解析muraymycinA1和B1的精確分子量和分子式超微量樣品離子化相關技術納升級電噴霧質譜(nano－ESI)技術的應用和發展使質譜的檢測限大為降低,達到nmol級,甚至amol級應用nano－ESI，用前體離子掃描定量分析了amol級的甾族化合物樣品應用nano－ESI四極杆飛行時間質譜測定了海藻中的一種單二甲基含砷糖現場樣品前處理質譜聯用技術應用脈衝超濾質譜，篩選並評價了多種COX2抑制劑應用固相微提取質譜技術,測定了幾種揮發和半揮發化學試劑和兩種除草劑，檢測靈敏度達到ppb級和ppt級在生命科學研究中的應用質譜與蛋白質分析

質譜與核酸研究質譜與臨床醫學質譜與檢測展望質譜與蛋白質分析蛋白質分子量的測定：MALI－MS技術

蛋白質組研究：1.多肽、蛋白質的品質2.肽指紋圖譜測定（肽指紋譜的方法比氨基酸組成分析更為可靠）3.氨基酸序列測定等（串聯質譜技術）

質譜與核酸研究ESI和MALDI質譜技術與寡核苷酸及其類似物的結構和序列分析

外切酶從3’或5’端進行部分降解，在不同時間內分別取樣進行質譜分析

質譜應用於DNA研究領域

M．L．Vestal和鄧慧敏等把離子延遲引出技術（lonDelayedExtraction,DE）應用於MALDI－MS中，測定混合堿基DNA，獲得了高解析度的DNA質譜圖。

質譜與臨床醫學對藥物代謝產物的動態分析癌細胞蛋白質的鑒定同位素標記物的檢測等

用同位素14C標記的14C-尿素呼吸試驗和15

N標記的15

N-排泄試驗已成為臨床檢測胃幽門螺桿菌（HP）的有效手段。

質譜與檢測生物工程產品與MALDI-TOF-MS

技術蔡耘等用上述技術對重組的人表皮生長因數（hEGF）白細胞介素-3（IL－3）、腫瘤壞死因數（TNF）粒細胞＼巨噬細胞集落刺激因數（GM－CSF）、粒細胞集落刺激因數（G—CSF）鹼性成纖維生長因數（bFGF）等六種基因工程產品進行了測定，獲得了準確的分子量資訊及純度資訊

1.1概述1.2紅外光譜與有機化合物結構1.3

分子中基團的基本振動形式1.4影響峰位變化的因素1.紅外光譜分析基本原理分子中基團的振動和轉動能級躍遷產生：振-轉光譜1.1概述紅外光譜圖：縱坐標為吸收強度，橫坐標為波長λ（μm）和波數1/λ

單位：cm-1可以用峰數，峰位，峰形，峰強來描述。應用：有機化合物的結構解析。定性：基團的特徵吸收頻率；定量：特徵峰的強度；1.2紅外光譜與有機化合物結構1.紅外光譜產生的條件

滿足兩個條件：

(1)輻射應具有能滿足物質產生振動躍遷所需的能量；

(2)輻射與物質間有相互偶合作用。

對稱分子：沒有偶極矩，輻射不能引起共振，無紅外活性。

如：N2、O2、Cl2

等。

非對稱分子：有偶極矩，紅外活性。偶極子在交變電場中的作用示意圖2.分子振動方程式分子的振動能級（量子化）：

E振=（V+1/2）h

V：化學鍵的振動頻率；

：振動量子數。(1)雙原子分子的簡諧振動及其頻率化學鍵的振動類似於連接兩個小球的彈簧(2)分子振動方程式任意兩個相鄰的能級間的能量差為：K化學鍵的力常數，與鍵能和鍵長有關，

為雙原子的折合品質

=m1m2/（m1+m2）發生振動能級躍遷需要能量的大小取決於鍵兩端原子的折合品質和鍵的力常數，即取決於分子的結構特徵。表某些鍵的伸縮力常數（毫達因/埃）鍵類型:—CC—>—C=C—>—C—C—力常數:15

179.5

9.94.5

5.6峰位:4.5m6.0m7.0m化學鍵鍵強越強（即鍵的力常數K越大）原子折合品質越小，化學鍵的振動頻率越大，吸收峰將出現在高波數區。1.3

分子中基團的基本振動形式

1．兩類基本振動形式伸縮振動亞甲基：變形振動亞甲基例１水分子２．峰位、峰數與峰強（1）峰位化學鍵的力常數k越大，原子折合品質越小，鍵的振動頻率越大，吸收峰將出現在高波數區（短波長區）；反之，出現在低波數區（高波長區）。（2）峰數峰數與分子自由度有關。無瞬間偶基距變化時，無紅外吸收。例2CO2分子（4）由基態躍遷到第一激發態，產生一個強的吸收峰，基頻峰；（5）由基態直接躍遷到第二激發態，產生一個弱的吸收峰，倍頻峰；（3）瞬間偶基距變化大，吸收峰強；鍵兩端原子電負性相差越大（極性越大），吸收峰越強；

1．內部因素（1）電子效應a．誘導效應：吸電子基團使吸收峰向高頻方向移動（藍移）1.4影響峰位變化的因素

化學鍵的振動頻率不僅與其性質有關，還受分子的內部結構和外部因素影響。各種化合物中相同基團的特徵吸收並不總在一個固定頻率上。R-COR

C=01715cm-1;R-COH

C=01730cm-1

；R-COCl

C=01800cm-1;R-COF

C=01920cm-1;F-COF

C=01920cm-1;R-CONH2

C=01928cm-1;ｂ．共軛效應cm-1cm-1cm-1cm-1

共軛效應使共軛體系中的電子雲密度平均化，使其吸收頻率向低波數方向移動。CHCHCHCH1576cm-11611cm-11644cm-11781cm-11678cm-11657cm-11651cm-1（２）空間效應

場效應；空間位阻；環張力CH3060-3030cm-12900-2800cm-12222（3）氫鍵效應

氫鍵(分子內氫鍵；分子間氫鍵)：對峰位，峰強產生極明顯影響，使伸縮振動頻率向低波數方向移動。2．外部因素溶劑效應物質的狀態2.1儀器類型與結構2.2制樣方法2.3聯用技術2.儀器與方法2.1儀器類型與結構

兩種類型：色散型干涉型（付立葉變換紅外光譜儀）內部結構Nicolet公司的AVATAR360FT-IR傅裏葉變換紅外光譜儀結構框圖干涉儀光源樣品室檢測器顯示器繪圖儀電腦干涉圖光譜圖FTS傅裏葉變換紅外光譜儀工作原理圖邁克爾干涉儀工作原理圖2.2制樣方法1）氣體——氣體池2）液體：①液膜法——難揮發液體（bp>80C）②溶液法——液體池溶劑：CCl4，CS2常用。3)固體:①研糊法（液體石臘法）②KBr壓片法③薄膜法2.3聯用技術GC/FTIR（氣相色譜紅外光譜聯用）LC/FTIR（液相色譜紅外光譜聯用）PAS/FTIR（光聲紅外光譜）MIC/FTIR（顯微紅外光譜）——微量及微區分析3.1紅外光譜的特徵性3.2有機化合物分子中常見基團吸收峰3.3基團吸收帶數據3.紅外光譜與分子結構3.1紅外光譜的特徵性

與一定結構單元相聯系的、在一定範圍內出現的化學鍵振動頻率——基團特徵頻率（特徵峰）；例：2800

3000cm-1—CH3特徵峰；1600

1850cm-1—C=O特徵峰；基團所處化學環境不同，特徵峰出現位置變化：—CH2—CO—CH2—1715cm-1

酮—CH2—CO—O—1735cm-1

酯—CH2—CO—NH—1680cm-1

醯胺紅外光譜與分子結構常見的有機化合物基團頻率出現的範圍：4000

670cm-1依據基團的振動形式，分為四個區：(1)4000

2500cm-1X—H伸縮振動區（X=O，N，C，S）(2)2500

1900cm-1

三鍵，累積雙鍵伸縮振動區(3)1900

1200cm-1

雙鍵伸縮振動區(4)1200

670cm-1

X—Y伸縮，

X—H變形振動區3.2有機化合物分子中常見基團吸收峰3.2.1．X—H伸縮振動區（4000

2500cm-1）（1）—O—H3650

3200cm-1

確定醇，酚，酸

在非極性溶劑中，濃度較小（稀溶液）時，峰形尖銳，強吸收；當濃度較大時，發生締合作用，峰形較寬。（3）不飽和碳原子上的=C—H（

C—H

）

苯環上的C—H3030cm-1

=C—H3010

2260cm-1

C—H3300

cm-1（2）飽和碳原子上的—C—H3000cm-1以上

—CH3

2960

cm-1

反對稱伸縮振動2870

cm-1

對稱伸縮振動

—CH2—2930

cm-1反對稱伸縮振動2850

cm-1

對稱伸縮振動

—C—H2890cm-1

弱吸收3000cm-1以下3.2.2．雙鍵伸縮振動區(1200

1900cm-1)（1）RC=CR’1620

1680cm-1

強度弱，

R=R’（對稱）時，無紅外活性。（2）單核芳烴的C=C伸縮振動出現在1600cm-1和1500cm-1附近，有兩個峰，這是芳環的骨架結構，用於確認有無芳核的存在。（3）苯衍生物在1650

2000cm-1出現C-H和C=C鍵的面內變形振動的泛頻吸收（強度弱），可用來判斷取代基位置。（4）C=O（1850

1600cm-1）碳氧雙鍵的特徵峰，強度大，峰尖銳。3.2.3．三鍵伸縮振動區(2500

1900cm-1)3.2.4.X—Y，X—H變形振動區<1650cm-

指紋區(1350

650cm-1),較複雜。

C-H，N-H的變形振動；

C-O，C-X的伸縮振動；

C-C骨架振動等。精細結構的區分。（1）RCCH（2100

2140cm-1）

RCCR’（2190

2260cm-1）

R=R’時，無紅外活性（2）RCN（2100

2140cm-1）非共軛2240

2260cm-1

共軛2220

2230cm-1

3.3基團吸收帶數據常見基團的紅外吸收帶特徵區指紋區500100015002000250030003500C-H，N-H，O-HN-HCNC=NS-HP-HN-ON-NC-FC-XO-HO-H（氫鍵）C=OC-C，C-N，C-O=C-HC-HCCC=C

紅外光譜法廣泛用於有機化合物的定性分析和定量分析。4.1定性分析

4.1.1.已知物的鑒定

將試樣的譜圖與標準的譜圖進行對照，或者與文獻上的譜圖進行對照。幾種標準譜圖（1）薩特勒（Sadtler）標準紅外光譜圖（2）Aldrich紅外譜圖庫（3）SigmaFourier紅外光譜圖庫4.紅外光譜法的應用4.1.2.未知物結構的測定測定未知物的結構，是紅外光譜法定性分析的一個重要用途。如果未知物不是新化合物，可以通過兩種方式利用標準譜圖進行查對：（1）查閱標準譜圖的譜帶索引，與尋找試樣光譜吸收帶相同的標準譜圖；（2）進行光譜解析，判斷試樣的可能結構，然後在由化學分類索引查找標準譜圖對照核實。

在定性分析過程中，除了獲得清晰可靠的圖譜外，最重要的是對譜圖作出正確的解析。所謂譜圖的解析就是根據實驗所測繪的紅外光譜圖的吸收峰位置、強度和形狀，利用基團振動頻率與分子結構的關係，確定吸收帶的歸屬，確認分子中所含的基團或鍵，進而推定分子的結構。簡單地說，就是根據紅外光譜所提供的資訊，正確地把化合物的結構“翻譯”出來。往往還需結合其他實驗資料，如相對分子品質、物理常數、紫外光譜、核磁共振波譜及質譜等數據才能正確判斷其結構。4.1.3譜圖的解析準備工作

在進行未知物光譜解析之前，必須對樣品有透徹的瞭解，例如樣品的來源、外觀，根據樣品存在的形態，選擇適當的制樣方法；注意視察樣品的顏色、氣味等，它們住往是判斷未知物結構的佐證。還應注意樣品的純度以及樣品的元素分析及其它物理常數的測定結果。樣品的相對分子品質、沸點、熔點、折光率、旋光率等物理常數，可作光譜解釋的旁證，並有助於縮小化合物的範圍。根據未知物不飽和度判斷

當

=0時，表示分子是飽和的，應在鏈狀烴及其不含雙鍵的衍生物。當

=1時，可能有一個雙鍵或脂環；當

=2時，可能有兩個雙鍵和脂環，也可能有一個三鍵；當

=4時，可能有一個苯環等。

根據上表可以粗略估計可能存在的基團，並推測其可能的化合物類別，然後進行紅外的圖譜解析。官能團分析根據官能團的初步分析可以排除一部分結構的可能性，肯定某些可能存在的結構，並初步可以推測化合物的類別。小結

圖譜的解析主要是靠長期的實踐、經驗的積累，至今仍沒有一一個特定的辦法。一般程式是先官能團區，後指紋區；先強峰後弱峰；先否定後肯定。首先在官能團區（4000~1300cm-1）搜尋官能團的特徵伸縮振動，再根據指紋區的吸收情況，進一步確認該基團的存在以及與其它基團的結合方式。如果是芳香族化合物，應定出苯環取代位置。最後再結合樣品的其他分析資料，綜合判斷分析結果，提出最可能的結構式，然後用已知樣品或標準圖譜對照，核對判斷的結果是否正確。如果樣品為新化合物，則需要結合紫外、質譜、核磁等數據，才能決定所提的結構是否正確。4.2定量分析

紅外光譜定量分析是通過對特徵吸收譜帶強度的測量來求出組份含量。其理論依據是朗伯-比耳定律。

由於紅外光譜的譜帶較多，選擇的餘地大，所以能方便地對單一組份和多組份進行定量分析。此外，該法不受樣品狀態的限制，能定量測定氣體、液體和固體樣品。因此，紅外光譜定量分析應用廣泛。但紅外光譜法定量靈敏度較低，尚不適用於微量組份的測定。紅外譜圖解析示例1．烷烴2.烯烴對比烯烴順反異構體3.醇氫鍵締合

基於物質光化學性質而建立起來的分析方法稱之為光化學分析法。分為:光譜分析法和非光譜分析法。光譜分析法是指在光（或其他能量）的作用下，通過測量物質產生的發射光、吸收光或散射光的波長和強度來進行分析的方法。

吸收光譜分析發射光譜分析分子光譜分析原子光譜分析１.基本原理

在光譜分析中，依據物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法,主要有:

紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長範圍2.51000m,主要用於有機化合物結構鑒定。

紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長範圍200400nm（近紫外區），可用於結構鑒定和定量分析。

可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長範圍400750nm，主要用於有色物質的定量分析。

１.２.1．光的基本性質

光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動性可用波長

、頻率

、光速c、波數（cm-1）等參數來描述：

=c

；波數=1/

=

/c

光是由光子流組成，光子的能量：

E=h=hc/

（Planck常數：h=6.626×10-34J×S)

光的波長越短（頻率越高），其能量越大。白光(太陽光)：由各種單色光組成的複合光

單色光：單波長的光(由具有相同能量的光子組成)

可見光區：400-750nm

紫外光區：近紫外區200-400nm

遠紫外區10-200nm（真空紫外區）１.２紫外可見吸收光譜

１.２.2.物質對光的選擇性吸收及吸收曲線M+熱M+螢光或磷光

E=E2-

E1=h

量子化；選擇性吸收;

分子結構的複雜性使其對不同波長光的吸收程度不同；用不同波長的單色光照射，測吸光度—吸收曲線與最大吸收波長

max；M+

h

M*

光的互補：藍

黃基態激發態E1

（△E）E2

（1）同一種物質對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應的波長稱為最大吸收波長λmax

（2）不同濃度的同一種物質，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對於不同物質，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。

（3）③吸收曲線可以提供物質的結構資訊，並作為物質定性分析的依據之一。（4）不同濃度的同一種物質，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質定量分析的依據。（5）在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據。吸收曲線的討論１.２.3.電子躍遷

物質分子內部三種運動形式：

（1）電子相對於原子核的運動（2）原子核在其平衡位置附近的相對振動（3）分子本身繞其重心的轉動分子具有三種不同能級：電子能級、振動能級和轉動能級三種能級都是量子化的，且各自具有相應的能量分子的內能：電子能量Ee

、振動能量Ev

、轉動能量Er

即E＝Ee+Ev+ErΔΕe>ΔΕv>ΔΕr

紫外-可見光譜屬於電子躍遷光譜。

電子能級間躍遷的同時總伴隨有振動和轉動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉動能級間躍遷產生的若干譜線而呈現寬譜帶。能級躍遷討論：（1）轉動能級間的能量差ΔEr：0.005～0.050eV，躍遷產生吸收光譜位於遠紅外區。遠紅外光譜或分子轉動光譜；（2）振動能級的能量差ΔEv約為：0.05～１eV，躍遷產生的吸收光譜位於紅外區，紅外光譜或分子振動光譜；（3）電子能級的能量差ΔEe較大1～20eV。電子躍遷產生的吸收光譜在紫外—可見光區，紫外—可見光譜或分子的電子光譜

（4）吸收光譜的波長分佈是由產生譜帶的躍遷能級間的能量差所決定，反映了分子內部能級分佈狀況，是物質定性的依據。（5）吸收譜帶強度與分子偶極矩變化、躍遷幾率有關，也提供分子結構的資訊。通常將在最大吸收波長處測得的摩爾吸光係數εmax也作為定性的依據。不同物質的λmax有時可能相同，但εmax不一定相同；（6）吸收譜帶強度與該物質分子吸收的光子數成正比，定量分析的依據。討論：１.３分子吸收光譜與電子躍遷

有機化合物的紫外—可見吸收光譜，是其分子中外層價電子躍遷的結果（三種）：σ電子、π電子、n電子。

分子軌道理論：一個成鍵軌道必定有一個相應的反鍵軌道。通常外層電子均處於分子軌道的基態，即成鍵軌道或非鍵軌道上。

外層電子吸收紫外或可見輻射後，就從基態向激發態(反鍵軌道)躍遷。主要有四種躍遷所需能量ΔΕ大小順序為：n→π＊

<π→π＊

<n→σ＊

<σ→σ＊

⑴

σ→σ＊躍遷

所需能量最大，σ電子只有吸收遠紫外光的能量才能發生躍遷。飽和烷烴的分子吸收光譜出現在遠紫外區(吸收波長λ<200nm，只能被真空紫外分光光度計檢測到)。如甲烷的λ為125nm,乙烷λmax為135nm。

⑵

n→σ＊躍遷

所需能量較大。吸收波長為150～250nm，大部分在遠紫外區，近紫外區仍不易觀察到。含非鍵電子的飽和烴衍生物(含N、O、S和鹵素等雜原子)均呈現n→σ*躍遷。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*躍遷的λ分別為173nm、183nm和227nm。

⑶π→π＊躍遷

所需能量較小，吸收波長處於遠紫外區的近紫外端或近紫外區，摩爾吸光係數εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，屬於強吸收。不飽和烴、共軛烯烴和芳香烴類均可發生該類躍遷。如：乙烯π→π*躍遷的λ為162nm，

εmax為:1×104L·mol-1·cm－1。

⑷n→π＊躍遷

需能量最低，吸收波長λ>200nm。這類躍遷在躍遷選律上屬於禁阻躍遷，摩爾吸光係數一般為10～100L·mol-1·cm-1，吸收譜帶強度較弱。分子中孤對電子和π鍵同時存在時發生n→π＊躍遷。丙酮n→π＊躍遷的λ為275nmεmax為22L·mol-1·cm-1（溶劑環己烷)。生色團與助色團生色團：

最有用的紫外—可見光譜是由π→π＊和n→π＊躍遷產生的。這兩種躍遷均要求有機物分子中含有不飽和基團。這類含有π鍵的不飽和基團稱為生色團。簡單的生色團由雙鍵或三鍵體系組成，如乙烯基、羰基、亞硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C㆔N等。助色團：

有一些含有n電子的基團(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它們本身沒有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當它們與生色團相連時，就會發生n—π共軛作用，增強生色團的生色能力(吸收波長向長波方向移動，且吸收強度增加)，這樣的基團稱為助色團。

有機化合物的吸收譜帶常常因引入取代基或改變溶劑使最大吸收波長λmax和吸收強度發生變化:

λmax向長波方向移動稱為紅移，向短波方向移動稱為藍移(或紫移)。吸收強度即摩爾吸光係數ε增大或減小的現象分別稱為增色效應或減色效應，如圖所示。紅移與藍移影響吸收峰位置的因素溶劑效應

由於溶劑對溶質分子基態和激發態的穩定化不同，溶劑極性增大，最大吸收峰位置改變：R帶藍移，K帶紅移。溶劑若形成氫鍵，則R帶藍移。結構共軛體系的共軛程度增高導致紅移。1.4.1朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先後於1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關係。A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關係。A∝c

二者的結合稱為朗伯—比耳定律，其數學運算式為：

A＝lg（I0/It)=εbc

A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L－１；

ε：摩爾吸光係數，單位L·mol－１·cm－１１.４光的吸收定律1.4.2摩爾吸光係數ε的討論

（1）吸收物質在一定波長和溶劑條件下的特徵常數；

（2）不隨濃度c和光程長度b的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，ε僅與吸收物質本身的性質有關，與待測物濃度無關；（3）可作為定性鑒定的參數；

（4）同一吸收物質在不同波長下的ε值是不同的。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸光係數，常以εmax表示。εmax表明了該吸收物質最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質可能達到的最大靈敏度。

（5）εmax越大表明該物質的吸光能力越強，用光度法測定該物質的靈敏度越高。ε>105：超高靈敏；

ε=(6～10）×104

：高靈敏；

ε<2×104：不靈敏。（6）ε在數值上等於濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。1.4.3.偏離朗伯—比耳定律的原因

標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發現：標準曲線常發生彎曲（尤其當溶液濃度較高時），這種現象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學性因素。

可見分光光度計2.儀器

紫外-可見分光光度計光源單色器樣品室檢測器顯示2.1.1.光源

在整個紫外光區或可見光譜區可以發射連續光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩定性、較長的使用壽命。

可見光區：鎢燈作為光源，其輻射波長範圍在320～2500nm。紫外區：氫、氘燈。發射185～400nm的連續光譜。2.1基本組成

2.1.2.單色器

將光源發射的複合光分解成單色光並可從中選出一任波長單色光的光學系統。

①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；

②准光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；

③色散元件：將複合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光後所得單色光聚焦至出射狹縫；

⑤出射狹縫。2.1.3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區須採用石英池，可見區一般用玻璃池。2.1.4.檢測器

利用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。2.1.5.結果顯示記錄系統檢流計、數字顯示、微機進行儀器自動控制和結果處理2.2分光光度計的類型

2.2.1.單光束

簡單，價廉，適於在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩定性。2.2.2.雙光束自動記錄，快速全波段掃描。可消除光源不穩定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合於結構分析。儀器複雜，價格較高。2.2.3.雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而後到達檢測器。產生交流信號。無需參比池。△

=1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導數光譜。3有機化合物紫外光譜解析

瞭解共軛程度、空間效應、氫鍵等；可對飽和與不飽和化合物、異構體及構象進行判別。

紫外—可見吸收光譜中有機物發色體系資訊分析的一般規律是：

⑴若在200～750nm波長範圍內無吸收峰，則可能是直鏈烷烴、環烷烴、飽和脂肪族化合物或僅含一個雙鍵的烯烴等。

⑵若在270～350nm波長範圍內有低強度吸收峰(ε＝10～100L·mol-1·cm-1),（n→π躍遷），則可能含有一個簡單非共軛且含有n電子的生色團，如羰基。

⑶若在2５0～300nm波長範圍內有中等強度的吸收峰則可能為芳香族化合物。

⑷若在210～250nm波長範圍內有強吸收峰，則可能含有2個共軛雙鍵；若在260～300nm波長範圍內有強吸收峰，則說明該有機物含有3個或3個以上共軛雙鍵。

⑸若該有機物的吸收峰延伸至可見光區，則該有機物可能是長鏈共軛或稠環化合物。

主要內容第一節核磁共振基本原理第二節核磁共振與化學位移第三節自旋偶合與自旋裂分第四節譜圖解析與結構確定△E=hν高能態低能態氫原子在外加磁場子中的取向r為旋磁比，h為Planck常數當E射=

hν射=△E

時，質子吸收電磁輻射的能量，從低能級躍起遷至高能級，這種現象即稱為核磁共振。凡是自旋量子數不等於零的原子核，都可發生核磁共振。常用1HNMR和13CNMR。第一節核磁共振基本原理共振條件(1)核有自旋(磁性核)(2)外磁場,能級裂分;(3)照射頻率與外磁場的比值

0/H0=

/(2)在1950年，Proctor等人研究發現：質子的共振頻率與其結構（化學環境）有關。在高解析度下，吸收峰產生化學位移和裂分，如右圖所示。由有機化合物的核磁共振圖，可獲得質子所處化學環境的資訊，進一步確定化合物結構。四、核磁共振波譜儀1．永久磁鐵：提供外磁場，要求穩定性好，均勻，不均勻性小於六千萬分之一。掃場線圈。2．射頻振盪器：線圈垂直於外磁場，發射一定頻率的電磁輻射信號。3．射頻信號接受器（檢測器）：當質子的進動頻率與輻射頻率相匹配時，發生能級躍遷，吸收能量，在感應線圈中產生毫伏級信號。4．樣品管：外徑5mm的玻璃管,測量過程中旋轉,磁場作用均勻。第二節化學位移遮罩作用與化學位移

理想化的、裸露的氫核；滿足共振條件：

0=

H0/(2

)產生單一的吸收峰；實際上，氫核受周圍不斷運動著的電子影響。在外磁場作用下，運動著的電子產生相對於外磁場方向的感應磁場，起到遮罩作用，使氫核實際受到的外磁場作用減小：

H=（1-

）H0

：遮罩常數。

越大，遮罩效應越大。

化學位移：

0=[

/(2)]（1-

）H0由於遮罩作用的存在，氫核產生共振需要更大的外磁場強度（相對於裸露的氫核），來抵消遮罩影響。

在有機化合物中，各種氫核周圍的電子雲密度不同（結構中不同位置）共振頻率有差異，即引起共振吸收峰的位移，這種現象稱為化學位移。化學位移的表示方法1．位移的標準沒有完全裸露的氫核，沒有絕對的標準。相對標準：四甲基矽烷Si(CH3)4（TMS）（內標）

位移常數

TMS=02．為什麼用TMS作為基準?(1)12個氫處於完全相同的化學環境，只產生一個尖峰；（2）遮罩強烈，位移最大。與有機化合物中的質子峰不重迭；（3）化學惰性；易溶於有機溶劑；沸點低，易回收。位移的表示方法

與裸露的氫核相比，TMS的化學位移最大，但規定

TMS=0，其他種類氫核的位移為負值，負號不加。

=[（樣-TMS)/

TMS]106(ppm)

小，遮罩強，共振需要的磁場強度大，在高場出現，圖右側；

大，遮罩弱，共振需要的磁場強度小，在低場出現，圖左側；常見結構單元化學位移範圍各種基團的δ值（1）δ

值從R-CH3,R2CH2,R3C-H

依次增加（2）δ

值從烴基、烯基、芳基依次增加；芳環中的π電子在外磁場作用下產生環流，使環上的H原子周圍產生感應磁場，其方向與外磁場相同，增強了外磁場，所以在外磁場強度還沒有達到H0

時，就發生能級躍遷，它的δ值特別大，稱為反遮罩作用。乙炔分子中π電子環流，產生的感應磁場對抗外加磁場，故質子受到遮罩。其δ值較烯烴的小。（3）δ

值隨著鄰近原子電負性的增加而增加：（4）δ

值隨著H原子與電負性基團距離的增大而減小，如：CH3CH3<CH3NH2<CH3OH<CH3FR-O-C-C-C-H<R-O-C-C-H<R-O-C-H電負性與質子相連元素的電負性越強，吸電子作用越強，價電子偏離質子，遮罩作用減弱，信號峰在低場出現。-CH3，

=1.6~2.0，高場；-CH2I，

=3.0~3.5,-O-H，-C-H，

大

小低場高場

價電子產生誘導磁場，質子位於其磁力線上，與外磁場方向一致，去遮罩。

價電子產生誘導磁場，質子位於其磁力線上，與外磁場方向一致，去遮罩。

苯環上的6個

電子產生較強的誘導磁場，質子位於其磁力線上，與外磁場方向一致，去遮罩。一、自旋偶合與自旋裂分二、峰裂分數與峰面積第三節自旋偶合與自旋裂分一、自旋偶合與自旋裂分

每類氫