生物化学大实验报告

生物化学大实验报告——谌星生物学（基地）【摘要】碱性磷酸酶是适于在pH约9-10的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称，它的作用是催化核酸分子脱掉5'磷酸基团，从而使DNA(或RNA)片段的5'-Pi末端转换成5'-OH末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。细菌碱性磷酸酶（BAP）是一种从大肠杆菌中分离纯化而来的一种酶，是分子生物学中常用的一种工具酶，它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶,为了了解并掌握蛋白分离与纯化以及相关性质，进行了生物化学大实验的操作，涉及到SDS检测表达蛋白、蛋白质印迹、亲和层析纯化、离子交换层析纯化、分子筛排层析测定活性BAP的蛋白质分子量以及BAP活力与比活力的测定。关键词：细菌碱性磷酸酶分离纯化一、材料与方法1.1研究对象本次选择的细菌为BL21大肠杆菌工程菌株，外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D—半乳糖），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。1.2研究内容1.2.1分子筛排阻层析测定活性BAP的蛋白质分子量首先是凝胶处理，然后是装柱、联机、上样、标准曲线的制作和目的蛋白分子量测定1.2.2离子交换层析纯化通过亲和柱纯化后的样品可再通过离子交换层析进行纯化。先是装柱，然后上样、洗脱及收集，再使离子交换柱再生。1.2.3亲和层析纯化亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使酶等生物分子分离纯化的技术。（1）.过夜BL菌以1:50扩培比进行扩培，至OD600＝0.5，需190r/min约1h20min，然后加入IPTG至终浓度为1mM，于28°C，160r/min-190r/min条件下诱导5h。（2）.诱导表达后的菌体5000r/min离心15min，弃去LB培养基。按10:1体积比重悬于破碎缓冲液中（即startingbuffer），5000r/min离心10min，弃上清，加入破碎缓冲液以及终浓度为1mg/mL的溶菌酶，30℃温浴15min。（3）.冰浴条件下，60％功率超声处理5min，超声4sec间隔12sec；再用40％功率超声处理5min，超声4sec间隔12sec。（超声要求：a.将菌液处理至清亮；b.始终保持低温环境；c.避免出现黑色沉淀）。（4）.将超声处理后的样品于4℃2000r/min离心10min，沉淀为细胞碎片，弃去。再于4℃12000r/min离心10min，上清为可溶性蛋白，沉淀即为包涵体。（如需纯化包涵体蛋白，沉淀可用破碎缓冲液冲洗两次，将1mL裂解液对应的包涵体溶于500L8M/L尿素中）。将上清再次于4℃12000r/min离心10min，进一步除去杂质。除用于亲和层析纯化外，于4°C保存至少1mL可溶性蛋白粗提液用于碱性磷酸酶活力和比活力。（5）.镍柱亲和层析纯化可溶性蛋白：=1\*GB3①将亲和层析介质用5柱体积灭菌超纯水冲洗；=2\*GB3②用5柱体积startingbuffer进行平衡柱子；=3\*GB3③将5-10mL的可溶性蛋白样品上柱，并可反复过柱2-3次；=4\*GB3④用含30mM咪唑的washbuffer冲洗约10-12柱体积；=5\*GB3⑤用3mL含有300Mm咪唑的elutionbuffer洗脱目的蛋白，每500L收集1管（为增加洗脱效率，每收集500L后可用elutionbuffer孵育柱子5min）；=6\*GB3⑥SDS－③由于装柱时是手工操作的，造成柱子密度不一，对实验结果也有影响。另外在进行电泳时，操作发生了错误，点样时没有往槽子里面加缓冲液，点完样后加缓冲液冲撞了样品，使之电泳后转膜不成功。综上所述，本次实验让我们了解了生化实验的基本操作，学会了分子筛排阻层析测定活性BAP的蛋白质分子量，离子交换层析纯化，亲和层析纯化，SDS检测表达蛋白，蛋白质印迹，活力和比活力的测定等各种方法。虽然得出的数据不是很符合标准实验，但是提供了一个根本的舞台。参考文献：[1]王生余,张真.半薄SDS—PAGE垂直式平板电泳法检测尿蛋白谱.肾脏病与透析肾移植杂志.1999-8-4[2]大孔温敏型蛋白质印迹水凝胶用于蛋白质的分离识别.分析化学,2009年37卷(10)[3]王乔，程蓓，潘伯群.免疫组化和蛋白质印迹中抗原一抗体反应方法的改进.解剖