中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析课件

2015年版《中国药典》微生物限度检查法计数法修订解析

中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析一、修订背景1、国际化（1）美国、欧盟、日本制药产品占世界市场份额的70-80%；ICHQ4B(药品管理部门对药典的互认)附录4A、4B和4C已经得出结论，美国药典、欧盟药典、日本药典中的微生物限度检验方法协调统一。（2）中国虽然不是ICH的成员国，但中国与国外制药行业交往日益增多，且中国药品要想进入国际市场，药品检验方法和标准的统一势在必行。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析一、修订背景2、方法科学性和灵活性（1）准确度：方法适用性试验模拟样品污染微生物后进行方法试验性验证。（2）精密度：结果判定以变化范围进行规定，符合微生物计数规律。（3）培养体系：采用更适宜的培养体系。（4）偏差调查：微生物检验结果偏差调查的引入。（5）与微生物指导原则、理念有机统一。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析一、修订背景3、兼顾国情：（1）适用性试验增加供试品对照组（2）菌种采用CMCC（3）检验量、样品制备依照《中国药典》2010年版，与ICH不同。主要工艺、剂型限制，例如贴剂检验量规定完全不同。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析一、修订背景4、依据以上原则修订后具有以下特点：（1）修订后的计数法明确了《中国药典》2010年版未规定的事项。如：该检查方法的适用范围，替代法的应用原则。（2）修订后的计数法合理性、有效性、准确性得以充分体现，结果更接近真实污染状况。如：方法适用性加菌方式发生变化。（3）修订后的计数法与美国、欧洲、日本药典协调后方法一致，对于采用国际、国内两套体系（检验方法和检验标准）的生产企业而言，在方法一致的前提下，检测结果具有可比性，减轻企业检验负担。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析二、格式变化一个部分微生物限度检查法三个部分1、非无菌产品微生物检查：微生物计数法2、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法3、药品微生物限度标准：标准部分合并一部和二部内容修订前修订后中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求1、检测环境（1）环境洁净度应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级单向流空气区域内进行。（2）现状：2010年版GMP环境分级以A、B、C、D定义，对于微生物检测环境无具体描述，与国家标准分级不一致；相应的监测方法有区别。制药企业难以制定对应的标准和检测方法。（3）国际协调案要求：在适宜的洁净度的环境中进行。（4）发展趋势：既要最大可能防止微生物污染，又要防止检验过程对环境和人员造成的危害。活动区域的合理规划及区分将提高微生物实验室操作的可靠性。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求1、检测环境（5）USP<1117>实验室分区原则：

1）实验区域划分合理：无菌、非无菌样品操作区域应与活菌培养区完全隔离，或采取其他无菌操作及防护措施减少污染事件发生概率。所有在实验室操作的关键检测过程在控制条件下执行。

2）无菌检查的较适宜环境：隔离器的使用。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求2、供试品前处理供试品需前处理不需前处理有抑菌作用无抑菌作用去除抑菌作用检查①方法适用性试验前处理方法对污染菌生长、检出的影响。中和剂灭活剂②可以通过方法适用性试验判断③验证抑菌活性去除的有效性，以及方法对污染菌生长、检出的影响中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求3、微生物计数法适用范围（1）微生物计数法适用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。（2）明确规定本法不适用于活菌制剂的检查。（3）明确规定本检查法可采用替代检查方法，包括自动检测方法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求4、微生物计数定义变化修订前修订后细菌数营养琼脂培养基霉菌和酵母菌数玫瑰红钠琼脂培养基（1）细菌数修订为需氧菌数（2）霉菌和酵母菌数修订为霉菌和酵母菌总数（3）需氧菌总数：生长在胰酪大豆胨琼脂培养基上所有菌数（包括霉菌和酵母菌数）（4）霉菌和酵母菌总数：一般生长在沙氏葡萄糖琼脂培养基上的所有菌落（包括细菌菌落数）。如果由于细菌的生长而使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含有抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基重新进行计数。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求5、计数方法（1）平皿法：包括倾注法和涂布法。该项下明确可使用直径较大平皿，且培养基的用量应相应增加。（2）薄膜过滤法（3）最大可能数（Most-Probable-NumberMethod,简称MPN）。MPN法用于微生物计数时精确度较差，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法时使用，不适用于霉菌计数。（4）方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求6、菌种（1）原则不同来源菌种在实际使用时应依据《中国药典》2010年版附录ⅩⅧG药品微生物实验室规范指导原则的要求，药品微生物检验用试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求（2）菌种编号CMCC——中国医学菌种保藏中心

CMCC(F)或CMCC(B)B——代表细菌F——代表真菌ATCC——美国标准菌种收藏中心著名的微生物保藏中心，创立于1899年，设在美国马里兰州罗克维尔市。收藏有细菌、真菌、动植物病毒、噬菌体、藻类和原生生物等16000株以上的微生物种株。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求（3）传代：试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代）。代的定义：每接种一次即为一代（有在新鲜的培养基上生长过程）CV1CV2CV3QC干燥菌种（0代）液体培养基复苏（1代）中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求（4）菌种的保藏1）冷冻：在低温下保藏，需要加入保护剂，例如甘油，可以减少冷冻对菌种的伤害，一般在低于-30℃或-70℃冰箱内保藏，是一种有效的长期储藏方法。2）冻干法保藏：是一种长期保藏菌种的方法，一般情况下购买的冻干菌种即为此种方法。使用时需要进行溶解、复壮、冷藏。3）冷藏：在2～8℃的冰箱保藏，是一种短期的有效的短期储藏方法。储藏方法符合药典要求。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求（5）菌种及菌液的制备各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。注意事项：1）使用前确认菌种身份2）根据生产商说明书复苏菌种3）使用接种技术，不要重复从菌种包装瓶中移取菌种或重新冷冻菌种。4）传代代数（每接种一次即为一代）5）菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求7、试验菌修订前修订后金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉大肠埃希菌铜绿假单胞菌中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求8、培养基修订前修订后（1）细菌计数：营养琼脂（2）霉菌和酵母菌计数：玫瑰红钠琼脂（3）酵母菌计数：酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂（4）菌液稀释液：0.9%氯化钠溶液（1）需氧菌总数：胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤（2）霉菌和酵母菌总数：沙氏葡萄糖琼脂（3）菌液制备培养基：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液修订前修订后试验菌株（1）营养琼脂：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（2）玫瑰红钠琼脂：白色念珠菌、黑曲霉（1）胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉（2）胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌（3）沙氏葡萄糖琼脂：白色念珠菌、黑曲霉中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析三、通用要求9、培养条件嗜热型微生物最适生长温度为45℃～58℃嗜温型为25℃～43℃嗜冷型为10℃～18℃金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌最适生长温度为37℃，白色念珠菌和黑曲霉最适生长温度为28℃，均为嗜温型微生物。修订前修订后细菌数：营养琼脂30℃～35℃3天需氧菌总数（TAMC）：胰酪大豆胨琼脂30℃～35℃3～5天霉菌及酵母菌数：玫瑰红钠琼脂23℃～28℃5天霉菌和酵母菌总数（TYMC）：沙氏葡萄糖琼脂23℃～28℃5～7天中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析四、培养基适用性检查修订前修订后范围固体培养基液体、固体培养基加菌量50～100cfu不大于100cfu培养温度营养琼脂：30～35℃玫瑰红钠：23～28℃胰酪大豆胨琼脂：30～35℃胰酪大豆胨肉汤：30～35℃沙氏葡萄糖琼脂：20～25℃培养时间细菌：48h真菌：72h细菌：不大于72h真菌：不大于5天可接受标准70%固体培养基：50%～200%（0.5～2）液体培养基：生长良好中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析四、培养基适用性检查培养基名称胰酪大豆胨肉汤（TSB）无菌性检查取已灭菌的TSB，于30～35℃培养不少于3天，培养基应澄清。试验用菌株枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌接种方法分别接种各试验用菌悬液于该培养基中，接种量不大于100cfu,摇匀，培养。适用性检查接种试验用菌株后，30～35℃培养不超过72小时，与对照培养基比较，试验菌应生长良好。（建议：培养基呈混浊的液体，或划线于相应的分离平板上，培养后呈现典型菌落）备注：该培养基同时用于稀释液的制备和控制菌检查时，需要考虑同时满足计数和控制菌检查培养基适用性检查控制要求。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析四、培养基适用性检查培养基名称胰酪大豆胨琼脂（TSA）无菌性检查取已灭菌的TSA注皿，于30～35℃培养3～5天，应无菌生长。试验用菌株枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉接种方法涂布法：表面接种不大于100cfu试验用菌悬液于TSA平板表面；倾注法：接种不大于100cfu试验用菌悬液于无菌平皿，倾注该培养基，轻轻摇匀。适用性检查枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌于30～35℃培养不超过3天；白色念珠菌、黑曲霉于30～35℃培养不超过5天与对照培养基比较，恢复率在50%～200%之间。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析四、培养基适用性检查培养基名称沙氏葡萄糖琼脂（SDA）无菌性检查取已灭菌的SDA注皿，于20～25℃培养不少于5～7天，应无菌生长。试验用菌株白色念珠菌、黑曲霉接种方法涂布法：表面接种不大于100cfu试验用菌悬液于SDA平板表面；倾注法：接种不大于100cfu试验用菌悬液于无菌平皿，倾注该培养基，轻轻摇匀。适用性检查白色念珠菌、黑曲霉于20～25℃培养不大于5天与标准培养基比较，恢复率在50%～200%之间。备注：该培养基用于控制菌白色念珠菌检查时，同时满足控制菌项下培养基适用性检查要求。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析四、培养基适用性检查培养基名称沙氏葡萄糖琼脂+抗生素（当细菌超标引起霉菌和酵母菌总数超标时用）无菌性检查取已灭菌的SDA注皿，于20～25℃培养不少于5～7天，应无菌生长。试验用菌株抑菌性检查：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌促生长能力：白色念珠菌、黑曲霉常用抗生素1、庆大霉素：广谱。对G-、G+菌有较好的的抗菌作用。2、氯霉素：广谱。对G-菌作用强；对G+菌作用不及青霉素与四环素接种方法涂布法：表面接种不大于100cfu试验用菌悬液于SDA平板表面；倾注法：接种不大于100cfu试验用菌悬液于无菌平皿，倾注该培养基，轻轻摇匀。适用性检查白色念珠菌、黑曲霉于20～25℃培养不大于5天与标准培养基比较，恢复率在50%～200%之间。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验1、供试品修订前修订后内容（1）液体供试品（2）固体、半固体或粘稠性供试品（3）需用特殊方法制备的供试液的供试品：①非水溶性②膜剂③肠溶及结肠溶制剂④气雾剂与喷雾剂⑤贴剂⑥具抑菌活性的供试品（1）水溶性供试品（2）水不溶性非油脂类供试品（3）油脂类供试品（4）需用特殊方法制备供试液的供试品：①膜剂②肠溶及结肠溶制剂③气雾剂与喷雾剂④贴剂备注：体系上供试液制备移至计数方法适用性试验部分，从结构上更合理。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验2、稀释液修订前修订后内容（1）pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（2）pH7.2磷酸盐缓冲液（3）pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）（1）pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（2）pH7.2磷酸盐缓冲液（3）pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）（4）增加胰酪胨大豆肉汤培养基*不局限上述稀释液中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验3.试验菌修订前修订后内容（1）术语变化：计数方法验证（2）细菌用三种菌株进行验证（3）菌液加入方式：平皿计数验证时菌液和供试液同时加入平皿，加菌量为50～100cfu（1）术语变化：技术方法适用性试验（2）总需氧菌计数用五种菌株试验（3）菌液加入方式：菌液加入供试液中，使每毫升供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu，且所加菌液的体积不超过供试液体积的1%。备注：培养时间、可接受标准同培养基适用性检查。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验4、方法修订前修订后内容备注：主要针对平皿法试验组供试液和菌液同时加入平皿中供试液中加入规定量的菌液供试品对照组供试液直接加入平皿中供试液，不加菌液按照试验组进行试验菌液对照组直接加入菌液到平皿中取不含中和剂、灭活剂及表面活性剂的稀释液加入规定量的菌液中和剂对照组稀释剂对照组中和剂、灭活剂及表面活性剂的稀释液中加入规定量菌液。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验常见的中和剂或灭活方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛、汞制剂亚硫酸氢钠酚类、乙醇、醛类、吸附物稀释法醛类稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸（尼泊金类）、双胍类化合物卵磷脂季铵类化合物（QACs）、碘、对羟基苯甲酸聚山梨醇酯水银巯基醋酸盐水银、汞化物、醛类硫代硫酸盐乙二胺四乙酸（EDTA）、喹诺酮类抗生素镁或钙离子磺胺类对氨基苯甲酸β-内酰胺类抗生素β-内酰胺酶删除内容中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验无抑菌性样品方法适用性-例<1>：多潘立酮片1、方法适用性试验前评估（1）根据处方进行分析，产品中是否有抑菌成分；（2）参照历史上曾经进行过的方法验证，根据历史数据判断产品是否有抑菌性；（3）也可以通过预实验判断样品中是否有无抑菌性。通过以上判断，起草方法适用性试验草案，确定方法适用性试验具体过程。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验无抑菌性样品方法适用性-例<1>：多潘立酮片2、通过以上评估，判断多潘立酮片无抑菌性，可以采用规定的稀释液制备方法，采用平皿（直径90mm）法进行方法适用性试验，具体如下：（1）样品制备：称取供试品10g，加至TSB中，制成1:10的供试液；（2）试验组：西区1：10供试液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液后摇匀；（3）菌液对照组：西区胰酪大豆胨肉汤9.9ml，每份中加入与试验组相同的试验菌悬液后摇匀；中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验无抑菌性样品方法适用性-例<1>：多潘立酮片（4）试验组和菌液对照组摇匀后，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取1ml至平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；每种试验菌平行2份。（5）供试品对照组：吸取1:10供试液1ml至平皿，平行4皿，其中两个倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，另两个倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，摇匀。（6）将以上平皿分别30～35℃或20～25℃培养，细菌培养不超过3天，真菌培养不超过5天，在3天和5天分别进行计数。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验无抑菌性样品方法适用性-例<1>：多潘立酮片（7）结果计算：判断试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组的比值是否在0.5～2范围内。如果是，则方法适用性试验结果满足要求。（8）建议：生产企业根据以上方法第二人及第三人进行确认。如果均满足要求，则该方法适用性试验通过，可以用于日常检验。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验3、试验结果-（1）需氧菌总数：菌种菌液对照组

试验组稀释度1:10

可接受标准（50%～200%）3天5天3天5天3天5天金黄色葡萄球菌53/42/26.5/铜绿假单胞菌47/41/23.5/枯草芽孢杆菌44/63/22/白色念珠菌3737353518.518.5黑曲霉69蔓延74蔓延34.5/①供试品对照组（TSA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#。②阴性对照组（TSA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验3、试验结果-（2）霉菌和酵母菌总数菌种菌液对照组

试验组稀释度1:10

可接受标准（50%～200%）3天5天3天5天3天5天白色念珠菌404625342023黑曲霉81蔓延83蔓延40.5/①供试品对照组（SDA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#。②阴性对照组（SDA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<2>：曲安奈德益康唑乳膏1、方法适用性试验评估：（1）处方及历史数据分析：益康唑对霉菌、酵母和部分阳性杆菌均具有抑菌性。（2）根据历史数据分析，曲安奈德益康唑乳膏对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、霉菌均有一定的抑菌性，需要进行稀释，加入中和剂对抑菌性中和后进行方法适用性试验。（3）微生物限度标准：需氧菌总数不大于102cfu/g、霉菌和酵母菌总数不大于101cfu/g。注意：如果采用稀释法，需氧菌总数的稀释度不大于1:100，霉菌和酵母菌总数的稀释度不大于1:10，否则有一个菌落生长，样品则不能满足限度质量标准要求。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<2>：曲安奈德益康唑乳膏2、根据以上判断，初步设定的方法适用性试验如下：（1）样品制备：称取供试品10g加入含有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤中，制成1:10的供试品溶液；吸取1:10的供试液20ml加入80ml含有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤中，摇匀制成1:50供试液。（2）试验组：①吸取1:50的供试液9.9ml，共10份，每份中加入0.1ml的要求试验菌悬液后摇匀，确认需氧菌总数测定方法。②另吸取1:10的供试液9.9ml，共4份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液后摇匀，确认霉菌和酵母菌总数的测定方法。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<2>：曲安奈德益康唑乳膏（3）中和剂对照组：吸取含有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤9.9ml，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀。（4）菌液对照组：吸取胰酪大豆胨肉汤9.9ml，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀。（5）供试品对照组：吸取1:50的供试液10ml加入直径14cm的3个平皿中，平行制备两份，加入TSA培养基；吸取1:10的供试液10ml加入直径14cm的3个平皿中，平行制备2份，加入SDA培养基，摇匀。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<2>：曲安奈德益康唑乳膏（6）试验组、中和剂对照组和菌液对照组摇匀后，分别从TAMC试验菌试管中吸取10ml加入直径14cm的3个平皿中，加入TSA培养基；另从真菌试管中分别吸取10ml加入直径14cm的3个平皿中，加入SDA培养基。（7）将以上平皿放入30～35℃或20～25℃培养，细菌培养不超过3天，真菌培养不超过5天，在3天和5天分别进行计数。（8）结果计算：①判断试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组的比值是否在0.5～2范围内。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<2>：曲安奈德益康唑乳膏②中和剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5～2范围内。③如果以上均满足要求，则适用性试验结果满足要求。（9）建议：生产企业根据以上方法第二人及第三人进行确认。如果均满足要求，则该方法验证成功，可以用以日常检验。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验3、试验结果-（1）需氧菌总数：菌种菌液对照组

试验组稀释度为1:50中和剂对照组

可接受标准（50%～200%）3天5天3天5天3天5天3天5天金黄色葡萄球菌79/73/73/39.5/铜绿假单胞菌83/83/63/41.5/枯草芽孢杆菌43/31/40/21.5/白色念珠菌7676064*70403838黑曲霉22蔓延015*30蔓延11/①供试品对照组（TSA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#；0cfu/平皿3#。②阴性对照组（TSA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#；0cfu/平皿3#。备注：五天计数时，试验组白色念珠菌、黑曲霉菌菌落比菌液对照组小。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验3、试验结果-（2）霉菌和酵母菌总数：菌种菌液对照组

试验组稀释度为1:10中和剂对照组

可接受标准（50%～200%）3天5天3天5天3天5天3天5天白色念珠菌7676064*70403838黑曲霉22蔓延015*30蔓延11/①供试品对照组（SDA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#；0cfu/平皿3#。②阴性对照组（SDA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#；0cfu/平皿3#。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<3>：酮康唑洗剂1、方法适用性试验评估：（1）处方集历史数据分析：该产品为抗真菌药，对白色念珠菌具有抑菌性或杀菌性。（2）根据历史数据分析，酮康唑洗剂对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌菌有一定的抑菌性，需要进行稀释，加入中和剂对抑菌性中和后进行方法适用性试验。（3）微生物限度标准为需氧菌总数不大于102cfu/g、霉菌和酵母菌总数不大于101cfu/g。注意：如果采用稀释法，需氧菌总数的稀释度不大于1:100，霉菌和酵母菌总数的稀释度不大于1:10，否则有一个菌落生长，样品则不能满足限度质量标准要求。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<3>：酮康唑洗剂2、根据以上判断，初步设定的方法适用性试验如下：（1）样品制备：称取供试品10g加入含有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤中，制成1:10的供试液；吸取1:10的供试液20ml加入80ml含有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤中，摇匀制成1:50供试液。（2）试验组：①吸取1:50的供试液9.9ml，共10份，每份中加入0.1ml的要求试验菌悬液后摇匀，确认需氧菌总数测定方法。②另吸取1:10的供试液9.9ml，共4份，每份中加入0.1ml的要求试验菌悬液后摇匀，确认霉菌和酵母菌总数测定方法。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<3>：酮康唑洗剂（3）中和剂对照组：吸取含有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤9.9ml，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀。（4）菌液对照组：吸取胰酪大豆胨肉汤9.9ml，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀。（5）试验组、中和剂对照组和菌液对照组摇匀后，分别从所有细菌试验菌试管中吸取10ml加入直径14cm的3个平皿中，加入胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取10ml加入直径14cm的3个平皿中，加入沙氏葡萄糖琼脂培养基。每种试验菌平行制备2份。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<3>：酮康唑洗剂（6）供试品对照组：吸取1:50的供试液10ml加入直径14cm的3个平皿中，平行2份，加入胰酪大豆胨琼脂培养基；吸取1:10的供试液10ml加入直径14cm的3个平皿中，平行2份，加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，摇匀。（7）将以上胰酪大豆琼脂平皿放入30～35℃，沙氏葡萄糖琼脂平皿放入20～25℃进行培养，细菌培养不超过3天，真菌培养不超过5天，在3天和5天分别进行计数。（8）结果计算：①判断试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组的比值是否在0.5～2范围内。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<3>：酮康唑洗剂②中和剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5～2范围内。③如果以上均满足要求，则适用性试验结果满足要求。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验3、试验结果-（1）需氧菌总数：菌种菌液对照组

试验组稀释度为1:50中和剂对照组

可接受标准（50%～200%）3天5天3天5天3天5天3天5天金黄色葡萄球菌43/36/43/21.5/铜绿假单胞菌20/18/17/10/枯草芽孢杆菌61/11/44/30.5/白色念珠菌52520054552626黑曲霉41蔓延26/36蔓延20.5/①供试品对照组（TSA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#；0cfu/平皿3#。②阴性对照组（TSA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#；0cfu/平皿3#。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验3、试验结果-（2）霉菌和酵母菌总数：菌种菌液对照组

试验组稀释度为1:10中和剂对照组

可接受标准（50%～200%）3天5天3天5天3天5天3天5天白色念珠菌58590065672929.5黑曲霉27蔓延15蔓延26蔓延13.5/①供试品对照组（SDA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#；0cfu/平皿3#。②阴性对照组（SDA）：0cfu/平皿1#；0cfu/平皿2#；0cfu/平皿3#。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<3>：酮康唑洗剂4、小结：用中和剂以及稀释法均不能使白色念珠菌和枯草芽孢杆菌恢复，进一步用薄膜过滤法进行方法适用性试验的优化：（1）用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml预湿滤膜；（2）取1:10的供试液10ml加入预湿后的滤膜中，立即过滤。（3）用含5%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗200ml，100ml/次，在第二次冲洗液中加入50cfu试验菌，滤干后将滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板上。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<3>：酮康唑洗剂（2）中和剂对照组①用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml预湿滤膜。②取10ml含聚山梨酯80的TSB加入预湿后的滤膜中，立即过滤。③用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗200ml，100ml/次，在第二次冲洗液中加入50cfu试验菌，滤干后将滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板上。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<3>：酮康唑洗剂（3）菌液对照组①用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml预湿滤膜。②用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗200ml，100ml/次，在第二次冲洗液中加入50cfu试验菌，滤干后将滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板上。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<3>：酮康唑洗剂（4）供试品对照组①用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml预湿滤膜。②取1:10供试液10ml加入预湿后的滤膜中，立即过滤。③用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗200ml，100ml/次，滤干后将滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板上。备注：培养温度及培养时间同平皿法，每一种试验用菌用一个滤膜。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验5、试验结果-（1）需氧菌总数：菌种菌液对照组试验组中和剂对照组

可接受标准（50%～200%）3天5天3天5天3天5天3天5天金黄色葡萄球菌55/47/42/27.5/铜绿假单胞菌30/32/24/15/枯草芽孢杆菌57/59/56/28.5/白色念珠菌5457445345552728.5黑曲霉38蔓延34蔓延36蔓延19/①供试品对照组（TSA）：0cfu/滤膜②阴性对照组（TSA）：0cfu/滤膜中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验5、试验结果-（2）霉菌和酵母菌总数：菌种菌液对照组

试验组稀释度为1:10中和剂对照组

可接受标准（50%～200%）3天5天3天5天3天5天3天5天白色念珠菌404407149602022黑曲霉405003454602025①供试品对照组（SDA）：0cfu/滤膜②阴性对照组（SDA）：0cfu/滤膜中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验抑菌性样品方法适用性-例<3>：酮康唑洗剂根据以上的方法适用性试验，最终的检验方法如下：(6)检查方法：薄膜过滤法①供试液制备：称取供试品10g加入含有中和剂聚山梨酯80的TSB。②用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml预湿滤膜。③取1:10的供试液10ml加入预湿后的滤膜中，立即过滤，用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗200ml，100ml/次，贴于胰酪大豆胨琼脂和沙氏葡萄糖琼脂培养基上。④将以上胰酪大豆琼脂平皿放入30～35℃培养3-5天，沙氏葡萄糖琼脂平皿放入20～25℃培养5-7天。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验5、MPNMPN法的最可能数法的精确性不及平皿法和薄膜过滤法，不适宜霉菌计数。因此该法仅在没有其他方法可供选择的情况下，作为需氧菌总数计数法。例如：食品国标中大肠菌群的MPN计数法（第一法），其优点在于少量菌在经过増菌后进行直接观察结果，通过查表得到计数结果。修订前修订后不涉及（1）增加MPN法的检验，同时增加其适用性试验的相关内容。（2）用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌进行适用性试验。（3）可接受标准：试验组的菌落数应在稀释剂对照组菌落数的95%置信限内。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验6、小结（1）抗菌活性的去除①增加稀释剂和培养基的用量；②加入中和剂或灭火剂；③采用薄膜过滤法和冲洗；④综合上述措施若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性，那么方法适用性试验中微生物祸首的失败可看做因为供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能（是否改成极难合适）被微生物污染。但是，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能是微生物生长的更高稀释级的公事业进行方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检测。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析五、计数方法适用性试验（2）影响因素①试验菌：革兰阴性菌、格兰阳性菌、霉菌和酵母菌；②菌液的制备：菌液制备及储存应当标准化，满足使用的菌液（群体）均一性，活性一致性；③采特定的试验条件：包括缓冲液、温度、水、光照应当标准化且经过验证；④回收测定的关键因素：培养基的质量、培养条件方法适用性条件与样品检测条件需一致。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析六、供试品检查1、检验量修订前修订后内容除另有规定外，一般供试品检验量为10g或10ml，膜剂为100cm2；贵重或微量包装药品的检验量可以逐减，出另有规定外，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液着不得少于3ml，外用药品不得少于5g。（1）除另有规定外，一般取10g或10ml供试品进行检测；对于液体或固体气雾剂，取10个容器单位检测；对于透皮吸收贴剂，取10贴检验。（2）每一计量单位（如片剂、胶囊剂、注射剂）活性物质含量小于或等于1mg，每g或ml活性物质含量低于1mg。这种情况下，检验量应不少于10个计量单位、10g或10ml。（3）对用作活性物质的材料，样品量有限或批量极小（如：小于1000ml或1000g）的，出更少检验量被证明合理外，检验量应为批量的1%。（4）对于批量少于200的产品（如临床诊断用品），取样量可减少至2个单位。对于批量少于100的产品，取样量减少至1单位。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析六、供试品检查2、阴性对照修订前修订后内容附录109-110页（1）平皿法：取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。（2）薄膜过滤法：取试验用稀释液1ml，照上述薄膜过滤法操作不得有菌生长。（1）排版放在所有检验及验证之前，更为合理。同时说明所有检验活动皆需要进行阴性对照。（2）未确认试验条件是否符合规定，应设立阴性对照组，以稀释剂代替供试品，阴性对照组应无菌生长。供试品检查时也需要进行阴性对照试验。如果对照有菌生长，应进行偏差调查。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析六、供试品检查3、计数修订前修订后内容

按计数方法的验证试验去人的程序进行供试液的制备，用稀释液稀释制成1:10、1:100、1:1000等稀释级的供试液。

按计数方法适用性试验去人的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。中国药典2015年版微生物限度检查法计数法修订解析六、供试品检查4、培养修订前修订后内容（1）描述方式：计数方法包括平皿法和薄膜过滤法，检查时，按已验证计数方法进行供试品细菌、霉菌和酵母菌数测定。（2）培养条件：细菌30～35℃培养3天，霉菌和酵母菌23～28℃培养5天，必要时可适当延长7天。（1）描述方式：按计数方法适用性试验确认计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的测定。（2）培养条件：胰酪大豆胨琼脂平板在30～35℃培养3-5天，沙氏葡萄糖琼脂平板在20～25℃培养5-7天；MPN法和供试品接种，所有试验管在30～35℃培养