5体内药物分析z课件

体内药物分析BiopharmaceuticalanalysisChap.52/18/20241精选2021版课件第一节体内药物分析概述

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药物分析的重要分支学科 ——研究生物机体中外源性药物及其代谢物

和内源性活性物质的质与量的变化规律 ——综合性较强的应用学科——分析方法学 ——治疗药物监测研究的重要的实验手段2/18/20242精选2021版课件

药物进入体内后

——经过吸收、分布、代谢和排泄等动力学过程

——化学结构和存在状态都可能发生变化

——在不同个体中存在差异（个体差异）

——进而直接影响到药物在不同个体中的治疗效应和毒副作用需对生物体内药物及其代谢物进行研究分析2/18/20243精选2021版课件狭义：利用现代分析仪器和分离手段对人和动物血液、尿和组织等样品进行定性定量的分析广义：通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产、临床应用作出评价体内药物分析的定义2/18/20244精选2021版课件一体内药物分析的性质体内药物分析是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学在探求科学用药规律与安全、有效、合理用药，在开发新药、保障健康长寿方面具有重要作用2/18/20245精选2021版课件二体内药物分析的作用和意义通过检测人（或动物）的体液或组织（生物样本）中的药物或特定代谢物的浓度，为临床药学研究提供必要的数据和相关信息2/18/20246精选2021版课件（一）在新药评价和开发中的意义

大量事实证明，如无临床药理学和临床药学研究给新药以确切的评价，要做到临床安全、合理、有效地用药将会遇到许多困难。因此，加强药物在生物样品内作用机理的研究，以了解和阐明药物药物结构、理化性质、剂型及生产工艺与药物疗效等关系，已成为评价药品质量的重要内容和依据。体内药物分析的意义2/18/20247精选2021版课件1．全面质量控制2．新药报批3．为设计新药提供信息①从代谢产物中开发新药保泰松→羟基保泰松（作用强、副作用小）非那西丁→扑热息痛②前药设计③新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决2/18/20248精选2021版课件（二）临床合理用药中的意义

1．血药浓度与药理作用2.影响血药浓度的因素（1）机体因素a．生理因素年龄、性别、生理状况b．病理因素c．遗传因素（2）药物因素a．剂型因素（生物利用度问题）b．药物合并使用（酶抑、酶促）c．时间因素2/18/20249精选2021版课件（三）药物中毒解救的意义药物中毒的诊断和治疗方案的确立（四）兴奋剂检测的意义包括麻醉药精神药品滥用，吸毒及运动员违禁药品检测2/18/202410精选2021版课件3．从样品的来源分1．从分析物分母体药物代谢物内源性物质2．从生物样品种类分均匀样品非均匀样品人体实验动物三体内药物分析的对象

2/18/202411精选2021版课件体内药物分析的对象研究对象

评价药物的安全性（临床前研究）—动物评价药物的有效性（临床研究）—人体（健康志愿者或患者）用药的安全、有效与合理—人体（患者TDM）具体检材

生物体的各种器官、组织和体液等2/18/202412精选2021版课件四体内药物分析的任务

1.分析方法学的研究和完善

——提供灵敏、专属、准确可靠的分析方法与最佳的分析条件（首要任务）2/18/202413精选2021版课件2.治疗药物监测TDM，therapeuticalDrugMonitoring只有具有明确治疗范围，血药浓度和药效关系密切，且具有下列情况者，要求进行药浓检测：有效血药浓度范围窄，剂量小，毒性大的药物；药代动力学个体差异大、药理作用强、不易估计给药后的血药浓度药物；2/18/202414精选2021版课件药物的毒性反应与该药治疗的疾病症状相似，难以判断是剂量不足还是药物毒性所致；联合用药时，由于药物相互作用产生不良反应，需要调整药物剂量者；在短期内难于判断疗效的药物，预测药物能否达到预防效果；判断患者用药的依从性等要求进行药物浓度检测。TDM2/18/202415精选2021版课件

3.药代动力学的研究

药物动力学参数、生物利用度及血浆蛋白结合率等基本数据——为新药研究、老药再评价、TDM、药物滥用、司法鉴定等提供准确的体内药物浓度数据和合理解释4.代谢分型的应用5.内源性物质测定——为某些疾病的诊断及治疗提供重要信息2/18/202416精选2021版课件五体内药物分析的特点——由分析对象的特点所决定

1．干扰物质多，样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析

——生物样品中含有大量的内源性物质，如蛋白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等干扰分析2．样品量少、不能重复取样

——生物样品多数在特定条件下采集，无法再次取样，且浓度低、变化幅度大——测定前需浓缩、富集以适应分析方法要求

2/18/202417精选2021版课件3．被测药物和代谢物的浓度或活性极低

——对方法的灵敏度及专属性要求较高4．要求分析方法简便、快速

——药物浓度监测和药物滥用及毒物分析中5.工作量较大，随着工作的深入开展，会成倍地甚或按指数级数6.测定数据的处理和阐明有时不太容易

2/18/202418精选2021版课件六体内药物分析的一般步骤

分析方法建立

分析方法的验证体内药物分析的实际应用2/18/202419精选2021版课件（一）对分析方法的新要求药物服用的剂量越来越小、体液中药物浓度越来越低，对体内药物分析方法提出了新的要求：1.检测方法的高灵敏度

——最低检测量10-9~10-7g或10-15~10-12g2.分离方法的高选择性、高专属性

2/18/202420精选2021版课件1.色谱法——GC、HPLC、HPCE2.免疫分析法——RIA、EIA3.联用技术——GC-MS、LC-MS为满足各项要求，最常用的分析方法有2/18/202421精选2021版课件（二）体内药物分析的常用分析方法1.光谱法

分光光度法、紫外光度法、荧光光度法

特点：操作简便，所需仪器一般临床实验室都具备，检测成本低，便于推广适于对治疗血药浓度水平较高，经适当处理方法用光谱法能满足临床需要的药物如阿司匹林、对乙酰氨基酚、氨茶碱、苯妥英钠、苯巴比妥钠等2/18/202422精选2021版课件

气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)

特点：特异性、灵敏度和重复性均好，并可一次同时完成同一样本中多种药物及其代谢物检测联用技术

如

GC-质谱、HPLC-质谱联机检测，更拓展了这类分析手段的性能2.色谱法2/18/202423精选2021版课件3.免疫化学法主要有放射免疫法(RIA)、荧光免疫法(FIA)和酶免疫法(EIA)根据抗原-抗体反应的特异性，应用免疫化学法检测半抗原或抗原性药物，TDM应用的免疫化学法一般都采用竞争性免疫分析只有具备完全或半抗原性的药物，并能制备特异性抗体，才可用免疫化学法进行TDM2/18/202424精选2021版课件

特点：免疫化学法灵敏度极高，大多可达ng甚至pg检测水平，可满足所有药物TDM的要求；所需标本量少，预处理及测定操作简便，并可制成商品化试剂盒；可利用一般生化、荧光自动分析仪进行自动化操作在体内几乎不发生代谢转化而以原型排泄的药物，较少代谢物干扰，尤其适用于免疫法检测，如庆大霉素等氨基甙类抗生素2/18/202425精选2021版课件在体药物分析示意图微透析系统活体实验动物微透析探针管子微注射器灌注液微注射泵检测系统分析仪器2/18/202426精选2021版课件治疗药物监测（therapeuticdrugmonitoring，TDM）是自本世纪60年代起，在临床药理学、药代动力学和临床化学基础上，结合现代分析检测技术，形成和发展的一门应用性边缘学科第二节治疗药物监测2/18/202427精选2021版课件

TDM

对临床药物治疗的指导，主要是指设计或调整合理的给药方案，同时为药物过量中毒的诊断和处理提供有价值的实验依据近年来国外又将其统称为临床药代动力学监测（ClinicalPharmacokineticMornitoring,CPM）2/18/202428精选2021版课件通过灵敏可靠的方法，检测病人血液或体液中的药物浓度，获取有关药动学参数，应用药代动力学理论，指导临床合理用药方案的制定和调整，以及药物中毒的诊断和治疗，以保证药物治疗的有效性和安全性，实现合理的给药方案个体化一治疗药物监测的主要任务2/18/202429精选2021版课件①治疗药物监测的核心目的是实现合理的给药方案个体化②协助诊断和处理药物过量中毒，及进行其临床药理学研究③了解患者是否遵医嘱用药，提高用药依从性二治疗药物监测的目的2/18/202430精选2021版课件①血药浓度结果用于调整剂量，设计个体化给药方案②一般只监测一次血药浓度，不测药物经时变化浓度③监测方法要求快速、简便、准确，以适应临床需求治疗药物监测与临床药代动力学研究的区别2/18/202431精选2021版课件治疗药物监测（TDM）利用各种分析技术测定血浆或组织中药物的浓度，并根据药代动力学的原理和公式来指导个体化给药方案，以提高疗效，避免或减少毒副作用的发生；为药物过量中毒的诊断和处理提供实验室依据三治疗药物监测的意义2/18/202432精选2021版课件据世界卫生组织（WHO）及我国卫生部药物不良反应监测中心的统计资料均显示，因用药不当而致死者远远高于同期死于各种传染病的人数。而用药不当死亡者中，大多是剂量不当所致。随着医疗技术整体水平的提高，在TDM指导下制定和调整个体化的合理用药方案，是药物治疗学发展的必然趋势

2/18/202433精选2021版课件临床治疗中的常规血药浓度监测是指测定规律服用某药物5个半衰期后已达稳定的血药浓度

用一般剂量或超过一般剂量仍不能控制病情时，通过监测可以了解病人是否规律用药、代谢率是否加快、有无耐药现象等

四何时需要进行治疗药物监测2/18/202434精选2021版课件联合应用药物，有可能影响药物代谢时或需要了解药物间的相互作用时伴发其他疾病(如肝、肾、胃、肠道疾病和低蛋白血症)时

药物的有效血药浓度范围狭窄（代表药物地高辛、奎尼丁等），在临床上不易区分毒性反应和确定剂量时，特别是有效量和中毒量接近的药物，通过测定可以及时调整药量

2/18/202435精选2021版课件某些药物的毒副作用表现与某些疾病本身的症状相似，不能明确辩别时（如地高辛、速尿等）长期用药的患者，依从性差；或产生耐药性；以及原因不明的药效变化时

出现特殊的症状和反应，怀疑是药物中毒时

2/18/202436精选2021版课件以下情况下无需TDM监测药物本身具有客观有效的效应指标时血药浓度不能预测药理作用强度时有效血药浓度范围宽的药物，一般也不需要做TDM2/18/202437精选2021版课件患者接受监测品种的药物治疗时，是否需要监测血药浓度，应根据临床具体情况判断。药师应协助临床严格把握TDM适应症，避免不必要的TDM申请五进行治疗药物监测应注意的问题1．严格把握TDM适应症，避免不必要的血药浓度测定2/18/202438精选2021版课件

2．快速提供准确的血药浓度测定结果3．直接面对临床开展TDM工作药师往往同时承担实验室技术人员、临床药师的双重任务，在做好实验室工作的同时，应深入临床，开展血药浓度的解释、利用工作

4．具体工作中熟练运用专业技能2/18/202439精选2021版课件六监测的药物种类

1）强心苷类 2）抗心律失常药 3）抗癫痫药 4）三环类抗抑郁药、抗狂躁药 5）抗哮喘药 6）氨基糖苷类及其他抗生素、抗肿瘤药 7）免疫抑制剂及抗风湿药等

需要指出的是，滥用TDM将造成不必要的浪费，应根据监测的原则和临床指征，确定有无必要进行常规化监测2/18/202440精选2021版课件需进行TDM的主要药物分类

药品强心甙地高辛、洋地黄毒苷抗心律失常药利多卡因、普鲁卡因胺、奎尼丁、乙胺碘呋酮、因卡胺、异丙吡胺等抗癫痫药苯妥英铵、苯巴比妥、乙琥胺、卡马西平、丙戊酸钠β受体阻断剂普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔平喘药氨茶碱抗抑郁药丙咪嗪、阿米替林、去甲替林等抗躁狂症药碳酸锂解热镇痛药阿司匹林、对乙酰氨基酚抗生素庆大霉素、链霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素等抗恶性肿瘤药甲氯蝶呤等免疫抑制剂环孢素利尿药呋塞米（速尿）2/18/202441精选2021版课件七治疗药物监测与体内药物分析的关系治疗药物监测的要求促进了体内药物分析学科的发展体内药物分析学为治疗药物监测提供分析方法和技术支持体内药物分析的发展和技术进步反过来促进了治疗药物监测的发展和完善2/18/202442精选2021版课件一、生物样品的种类、采集和制备

血液(血浆、血清)—体现药物浓度和治疗作用之间的关系——最常用的生物样本

生物样品脏器组织体液血液、尿液、唾液、毛发、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等第三节生物样品的预处理2/18/202443精选2021版课件（一）样品的采集1．血样血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。血细胞血浆（plasma）血小板血清（serum）血细胞测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓抗凝自然全血血液2/18/202444精选2021版课件

血样主要应用于：

药物动力学生物利用度临床治疗药物浓度监测第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集血样的应用2/18/202445精选2021版课件2．尿样

目的：药物剂量回收，药物清除率，生物利用度和，预测药物代谢过程、类型体内药物清除主要是通过尿液排出，药物以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代谢物等多种形式排出

特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分离2/18/202446精选2021版课件3．唾液一些药物的唾液药浓(S)与血浆游离药浓(P)密切相关，因此： —TDM中利用对S的测定代替对P的监测 —药代动力学的研究

收集方法离心收集2/18/202447精选2021版课件（二）样品的贮藏1．血样（血浆、血清）及时分离→冷藏，-70℃加入稳定剂NaF2．尿样①尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长，4℃保存②加入防腐剂a．1%甲苯b．饱和氯仿c．pH改变3．唾液：同血样2/18/202448精选2021版课件二、生物样品的预处理（一）预处理的目的①存在形式的多样性游离结合代谢物②浓度低，杂质多（分离浓缩）③出现浑浊和沉淀④与试剂起反应⑤影响色谱柱寿命2/18/202449精选2021版课件（二）处理方法选择的一般原则1．药物理化性质pKa亲脂性挥发性溶解度光谱特征稳定性2．浓度范围灵敏的方法3．测定的目的定性定量母体代谢4．生物样品的种类5．样品处理与分析方法的选择①专一性②灵敏性2/18/202450精选2021版课件（三）生物样品去蛋白处理1．加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐甲醇乙腈甲醇1:2乙腈1:1.5（NH4）2SO4NaCl2．加入酸性沉淀剂三氯醋酸高氯酸苦味酸等使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而↓，pH低于等电点2/18/202451精选2021版课件3．组织酶消化法加入酶使蛋白质水解优点：①平衡条件下进行，可避免反应和降解②可改善对蛋白结合率强的药物的回收率③不产生乳化4．其他加热超滤2/18/202452精选2021版课件（四）生物样品中缀合物水解1．酸水解2．酶水解β-葡萄糖醛酸苷酶芳基硫酸酯酶混合酶pH4.5-7.037℃3．溶剂解某些药物的硫酸酯，往往加入率取溶剂时发生分解，同时提取有机溶剂中2/18/202453精选2021版课件（五）生物样品的萃取1．液-液萃取（1）优点：①与杂质分离②简便③浓集④提取率高（2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取，>70%重现性2/18/202454精选2021版课件（3）影响提取率的因素①pH碱性药物在碱性pH酸性酸性pH②提取溶剂相似相溶原理沸点低，不影响检测,性质稳定，不起化学反应③离子强度加入中性盐增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取2/18/202455精选2021版课件（4）离子对提取对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取①原理②应用阴离子：COOH+SO3H-反离子四丁基铵阳离子：NH2+反离子烷基或芳基磺酸盐（5）提取技术一般在试管中进行,有机相与水相比1:1或2:12/18/202456精选2021版课件（6）乳化问题措施①轻缓振摇②含有分散度大或不溶物应过滤掉③避免在高pH条件下，从水中提取药物④避免使用易发生乳化的溶剂⑤萃取剂水中加入少量NaCl2/18/202457精选2021版课件破乳方法①机械法②加入少量高级脂肪醇改变表面张力③改善混合溶剂比例，增加分散相分数（7）药物的吸附①玻璃容器吸附1%三甲一氯硅烷10%二甲二氯硅烷②血浆2/18/202458精选2021版课件2．液固萃取固相萃取[solidphaseextractionSPE]针管式抽空减压加压过滤2/18/202459精选2021版课件（1）固相萃取步骤①固相选择样品1ml1ml规格固相1~25ml3ml规格固相②固相处理反相C18固定相的6~10倍体积甲醇洗柱，使溶剂化；6~10倍水缓冲服液冲洗达分离状态③上样④分离用适当的弱溶剂洗涤洗去杂质，通N2干燥固相⑤洗脱待测物改变pH或极性2/18/202460精选2021版课件（2）影响固相萃取的因素①流速流速快，按触不充分，样品流失回收率低柱处理5~10ml·min-1洗脱0.2~1ml·min-1（〈300mg〉2~5ml·min-1（>300mg）②装样过载突破性试验已知浓度样品液小体积上柱→洗脱回收百分率加大体积→洗脱回收百分率绘图当回收率下降时为过载2/18/202461精选2021版课件（六）生物样品的组分浓集（七）衍生化处理GC衍生化HPLC衍生化2/18/202462精选2021版课件第四节体内药物分析方法的建立与评价一、分析方法灵敏度专属性光谱法++刚开始应用较多双波长，导数色谱法++++++HPLCGC免疫法++++++免疫交叉反应，重现性差根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的2/18/202463精选2021版课件二、分析方法的设计依据方法的建立原始方法改进→创新创立方法2/18/202464精选2021版课件1．做好文献总结2．充分了解药物特征及体内状况pH、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况3．明确测定目的、要求目的药浓监测药代动力学研究母体药物和代谢物4．结合实验室条件设备条件预处理方法2/18/202465精选2021版课件三、分析方法的建立1．纯品进行测定确定线性范围、灵敏度、反应条件（pH、t、T）2．空白样品测定确定空白样品是否有干扰3．以水代替空白样品，加标准液后测定了解提取率、检测浓度确定萃取条件、pH、挥发浓缩等4．空白样品加入标准液测定标准曲线建立回归方程回收率5．实验样品测定2/18/202466精选2021版课件四、分析方法的评价可行性和可靠性

1．准确度accuracy

测定结果与真实性的差异用回收率表示①接近100%②相对恒定2/18/202467精选2021版课件①绝对回收率也称萃取回收率、提取回收率测定血浆样品中药物浓度/相同浓度的标准液=绝对回收率考虑3个浓度（高、中、低）分布在标准曲线成上、中、下一般要求绝对回收率在≥70%一般方法 HPLC内标内标法时注意：药物与内标用各自外标法测定回收率应相近，差值<10%2/18/202468精选2021版课件②相对回收率方法回收率药物系列浓度+血样→标准曲线取高、中、低三浓度加入到空白血浆中，处理后测定，与加入标准量相比，得方法回收率，测定值<15%，定量限<20%注意问题：a．加入药量与实际测定值相近b．加入物与实际存在状态相近c．空白试验与已确定方法进行比较2/18/202469精选2021版课件2．精密度precision

①标准差SD②相对标准