二代测序技术在血液系统疾病中的应用浅谈课件

二代测序技术

在血液系统疾病中的应用1精选课件SequencingtheHumanGenomeYearprice2010199720081086422010:10K$,

afewdays?2007:4541M$,3months2001:Celera100M$,3years2001:HumanGenomeProject2.7G$,11yearsTrendsinSequencingTechnology2003Sanger2008:ABISOLiD60K$,2weeks2009:Illumina,Helicos40-50K$2012:5K$,<24hrs?2015:1K$,<24hrs?20152精选课件三代测序技术1

1代测序－双脱氧终止法（Sanger）22代测序(454,solexa,SOLiD)33代测序(单分子测序)

TrendsinSequencingTechnology3精选课件1代测序——SangerSequencing利用DNA聚合酶和双脱氧链终止测定DNA核苷酸序列的方法。英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家FredSanger及其同事在1997年发明的。

优点片段长度(~900bps)适用于小片段

缺点低通量费用高、耗时长TrendsinSequencingTechnology4精选课件二代测序，高通量测序（NextGenerationSequencing、High-throughputSequencing、DeepSequencing）:一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，从而可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析。目前主要有LifeTech的SOLiD系列、IonTorrentPGM和IonTorrentProton；Illumina的HiSeq和MiSeq序列；罗氏公司的Roche/454GSFLX和Junior。TrendsinSequencingTechnology2代测序——NextGenerationSequencing(NGS)通量高准确度高分辨率高成本下降5精选课件TrendsinSequencingTechnology6精选课件HighParallelismisAchievedinPolonySequencingPolonySanger7精选课件3代测序——单分子测序：HeliScopeDNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。第三代测序技术基因组也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序。第三代测序技术发明人：StephenWTurner&JonasKorlach博士基因测序技术逐渐成为临床分子诊断中重要技术手段第三代测序技术的应用在测序、甲基化研究、突变鉴定（SNP检测）8精选课件三代技术对比阅读长度Readlength测序技术SequencingTechnology输出数据Throughput(perrun)费用Cost(1mbp)*Sanger~800bpSanger400kbp500$454~400bpPolony500Mbp60$Solexa75bpPolony20Gbp2$SOLiD75bpPolony60Gbp2$Helicos30-35bpSinglemolecule25Gbp1$*Source:Shendure&Ji,NatBiotech,20089精选课件基于NGS肿瘤研究思路10精选课件DNA水平全基因组重测序（Wholegenomesequencing）外显子组测序（Wholeexomesequencing）RNA水平转录组测序（Transcriptomesequencing）数字表达谱测序（Digitalexpressionprofiling）小RNA测序（SmallRNAsequencing）长链非编码RNA测序（LongchainnoncodingRNAsequencing）表观遗传水平免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)全基因组甲基化测序（Wholegenomemethylationsequencing）简化甲基化测序（Simplifiedmethylationsequencing）NGS几种方法11精选课件全基因组测序绘制体细胞突变图谱在全基因组范围内鉴定基因组变异信息。统计变异类型。筛选变异基因。注释突变基因功能全基因组范围12精选课件外显子组测序捕获外显子区域DNA进行进行高通量测序统计变异类型筛选变异基因注释突变基因功能1-2%基因组序列13精选课件转录组测序针对样品在特定组织特定状态下的全部mRNA进行分析鉴定转录本结构变异鉴定差异表达基因变异基因及差异表达基因功能注释14精选课件数字表达谱测序简便快速的定量检测疾病、不同阶段和特定状态下的组织基因表达的种类和表达水平信息。鉴定差异表达基因差异表达基因功能注释15精选课件小RNA测序快速发掘鉴定并定量分析不同组织、不同疾病状态下已知和潜在miRNA及其差异表达。鉴定差异表达miRNA差异表达miRNA及其靶基因功能注释16精选课件长链非编码RNA测序系统识别、鉴定lncRNA，比较分析不同组织间的lncRNA差异表达信息。lncRNA序列变异分析鉴定差异表达lncRNA差异表达lncRNA功能注释17精选课件免疫共沉淀测序通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等相互作用的DNA区段信息统计测序数据在参考基因组peak区不同样品差异分析差异基因功能注释18精选课件甲基化测序DNA进行重亚硫酸盐处理并高通量测序,检测所有的甲基化位点，绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱差异甲基化区域分析多样品间差异甲基化分析19精选课件NGS在血液系统疾病中的临床应用

全基因组测序

（全基因组~3Billionbp）全外显子测序

（~30Mbp）

测序限于基因组〜1％的蛋白质编码区基因突变

髓系MyeloidAML预后指标

–FLT3,NPM1,CEBPA,ASXL1,

IDH1/2骨髓增生异常综合征(MDS)–凝集素及剪切基因经常发生突变

骨髓增生性肿瘤(MPNs)–JAK2,CALR,MPL,

ASXL1

泛白血病基因淋系Lymphoid

弥漫性大B细胞淋巴瘤(BCR信号通路突变)淋巴细胞增殖性疾病(JAK-STAT信号通路突变)

泛淋巴瘤基因检测复杂的基因组异常-拷贝数变异（CNV）和易位

先天性疾病-骨髓衰竭综合征，先天性溶血性贫血

高度复杂的单基因分析

例如：淋巴细胞克隆性和IGH或TRG/TRB基因20精选课件NGS在血液系统疾病的中临床应用路径AMLMDSALLMPNAPLCML患者化疗靶向治疗免疫治疗HSCT巩固治疗诊断危险度分层疗效评价预后分析复发监测微小残留病检测（MRD)诊断危险度分层疗效评价预后分析复发监测微小残留病检测（MRD)辅助诊断指导用药复发监测21精选课件一项癌症基因组图谱研究网络（TheCancerGenomeAtlasResearchNetwork，TCGA）的研究200例初诊的AML患者50例全基因组测序，150例外显子测序AML患者中平均有13个基因发生突变23基因突变较为显著

（>5%的病例）NGS在AML中的应用22精选课件AML基因图谱Blood.2016January7;127(1):29–41.

23精选课件NGS在MDS中的应用738例MDS,MDS‐MPN患者通过NGS检测了111个癌症相关基因，结果显示：78%的患者至少有1种致癌基因的突变骨髓或外周血提取DNA没有系统差异致癌基因突变的总数越多，结果越差24精选课件髓系肿瘤突变图谱AML,MDS,MPN,MDS/MPNMatyniaetaletal.2015.ArchivesofPathologyandLaboratoryMedicine.25精选课件总生存率复发率Iveyetal.,NEnglJMed2016;374:422-33MRDinStandard-RiskAML有MRD的患者预后差，复发率高26精选课件Iveyetal.,NEnglJMed2016;374:422-33MRDinStandard-RiskAML有MRD携带FLT3-ITD的患者复发率高复发无FLT3-ITDmutations复发有FLT3-ITDmutations27精选课件Iveyetal.,NEnglJMed2016;374:422-33MRDinStandard-RiskAML有MRD携带DNMT3A的患者复发率低复发withoutDNMT3Amutations复发withDNMT3Amutations28精选课件NGS在T-ALL中的应用

NGS（外显子测序，全基因组测序或转录组测序）已经鉴定出T-ALL中突变的100多个基因。只有两个基因NOTCH1和CDKN2A/2B在超过50％的T-ALL病例中突变，其余基因以较低的频率突变29精选课件63个基因的靶向测序（TGS）相关信号通路相关基因NOTCH信号通路NOTCH1、FBXW7NF-κB信号通路MYD88、RIPK1、DDX3X、TRAF3、TRAF2、SAMHD1、BIRC3、BRAF、EGR2、IRF4、BCOR、BTK、NFKBIE、TNFAIP3、CD79B、ITPKB、CARD11、PLCG2Wnt信号通路MED12、FUBP1、MGA、MYCDNA损伤及细胞周期相关POT1、ATM、CHEK2、DYRK1A、BRCC3、TP53表观遗传学相关HIST1H1B、HIST1H1E、DDX3X、ZMYM3、CHD2、EZH2、KMT2C、KMT2D、BAZ2A、TET2、CREBBP、EP300、ASXL1、IKZF3RNA和核糖体加工SF3B1、EWSR1、NXF1、XPO4、RPS15OthersFAT1、FAT3、IGLL5、MTOR、CACNA1E、BCL6、PRDM1、BCL2、PIM1、KIT、KLHL6、CXCR4、PIK3CA、SOCS1NGS在CLL临床诊疗中的应用30精选课件不同的panel针对不同的需求IG/TCR产品名称检测方法ALL（10种）NGS检测AML-MDS-MPN（34基因）NGS检测MPN/MDS（25种）NGS检测髓系-large（58种）NGS检测AML（22种）NGS检测ABL激酶区NG