DNA基本技术专题知识教学课件

DNA基本技术专题知识DNA基本技术专题知识第1页第一节

核酸印迹技术与分子杂交NucleicAcidBlottingandMolecularHybridizationDNA基本技术专题知识第2页什么是核酸分子杂交

核酸分子杂交（nucleotidemolecularhybridization）以DNA变性、复性为理论基础指含有一定同源序列两条核酸单链（DNA或RNA）,在一定条件下按碱基互补配对标准经过复性处理后,形成异源双链过程DNA基本技术专题知识第3页一、Southern印迹可用于分析基因

拷贝数改变由E.M.Southern在1975年提出可用于分析基因拷贝数改变基础操作过程包含待测DNA样品制备和基因探针标识;待测DNA样品电泳分离;电泳分离DNA经变性、转移、固定到适宜固相支持物;特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交,放射自显影或显色检测目DNA存在。DNA基本技术专题知识第4页Southern印迹分析基础步骤滤纸NC膜凝胶滤纸电泳 转移杂交，显影酶切DNA样品上样 DNA印迹重物缓冲液DNA基本技术专题知识第5页二、Northern印迹和RT-PCR可用于

分析基因转录水平改变Northernblot是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上,定性分析mRNA常见方法;RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA为模板进行特异性扩增,进行RNA定性或定量分析一个方法;二者均可用于分析基因转录水平改变。DNA基本技术专题知识第6页三、原位分子杂交技术可用于基因及其表示产物定位分析原位杂交（insituhybridization,ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表示产物定位分析一个技术;可用于基因及其表示产物定位分析。DNA基本技术专题知识第7页FISH箭头所表示为杂交信号,结合带型分析可判定染色体位置DNA基本技术专题知识第8页第二节

聚合酶链式反应PolymeraseChainReactionDNA基本技术专题知识第9页什么是聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是一个在体外特异地扩增已知基因方法;由K.Mullis于1983年建立;可用于分析基因及其产物水平改变;可进行实时、定量分析;可结合免疫沉淀方法确定蛋白质与DNA序列相互作用。DNA基本技术专题知识第10页PCR技术工作原理5`3`3`5`5`3`3`5`++5`5`变性、退火引物5`3`3`5`+5`5`dNTPsTaqDNA聚合酶不一样长度新链DNA循环1+引物变性、退火DNA基本技术专题知识第11页25～30次循环后,模板DNA得到扩增5`3`3`5`+5`3`3`5`++5`3`3`5`+5`3`3`5`++dNTP TaqDNA聚合酶均一长度新链DNA循环2DNA基本技术专题知识第12页一、PCR技术分析基因及其产物反转录PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）是将RNA反转录反应和PCR反应联合应用一个技术。RT-PCR是现在从组织或细胞中取得目基因以及对已知序列RNA进行定性及半定量分析最有效方法。DNA基本技术专题知识第13页mRNA5

AAAAAA(n)3

mRNA5

AAAAAA(n)3

TTTTTT(n)5mRNA5

cDNA3AAAAAA(n)3

TTTTTT(n)5AAAAAA(n)3

TTTTTT(n)5oligo(dT)12-18反转录酶RNaseHDNA聚合酶S1核酸酶3

cDNATTTTTT(n)5AAAAAA(n)3

TTTTTT(n)5反转录合成cDNADNA基本技术专题知识第14页二、PCR技术能够进行实时、

定量分析QR3'3'5'5'上游引物下游引物荧光标识引物RQ3'3'5'5'DNA基本技术专题知识第15页三、PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质

结合DNA序列DNA基本技术专题知识第16页第三节

DNA序列测定DNASequencingDNA基本技术专题知识第17页*DNA序列分析方法演变和发展20世纪70年代双脱氧链终止法:F.Sanger化学裂解法:A.Maxam和W.Gilbert20世纪80年代PCR及自动测序技术DNA基本技术专题知识第18页一、DNA序列分析有双脱氧链终止法和

化学裂解法

（一）Sanger双脱氧链终止法利用2′,3′-双脱氧核苷酸掺入中（二）Maxam-Gilbert化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基止聚合反应DNA基本技术专题知识第19页双脱氧链终止法DNA基本技术专题知识第20页GATC

测序反应

电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'

3'

正极负极ddGddAddTddCDNA基本技术专题知识第21页DNA序列自动分析ddG红ddTddA绿ddC蓝橙毛细管电泳荧光标识DNA合成测序结果展示DNA基本技术专题知识第22页二、DNA序列分析能够揭示基因和

基因组一级结构改变经过DNA序列分析能够判定基因和基因组变异经过DNA序列测定分析人工重组基因经过DNA序列测定对定点突变进行确定DNA基本技术专题知识第23页第四节

DNA芯片技术DNAChipTechnologiesDNA基本技术专题知识第24页什么是DNA芯片技术DNA芯片（DNAchip）在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针,与待测荧光标识样品进行杂交;经过对杂交信号检测、比较和分析,得出样品遗传信息(基因序列及表示);亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。DNA基本技术专题知识第25页基因芯片工作步骤DNA基本技术专题知识第26页一、利用DNA芯片技术可同时进行高通量基因转录活性分析cDNA芯片每个探针是cDNA片段或基因一段PCR产物,能够同任何含有同源序列样品形成杂交体,同时定量监测大量基因表示。寡核苷酸芯片利用基因特异寡核苷酸片段为探针,每个基因有10~20个相对应探针,对低丰度基因表示水平改变检测含有高度灵敏性。DNA基本技术专题知识第27页二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合检测蛋白质-DNA相互作用染色质免疫共沉淀-芯片（chromatinimmunoprecipitation-chip,ChIP-on-chip）特异性地富集目蛋白结合DNA片段,解交联后对目片段进行纯化、扩增和荧光标识,再用于芯片分析;寻求特异性蛋白在基因组中结合位点,取得蛋白质与DNA相互作用信息。DNA基本技术专题知识第28页ChIP-on-chip工作原理DNA基本技术专题知识第29页第五节

酵母及哺乳动物细胞杂交系统YeastandMammalianHybridSystemsDNA基本技术专题知识第30页一、酵母双杂交探测蛋白-蛋白相互作用酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）由S.Fields和O.Song于1989年提出并初步建立DNA基本技术专题知识第31页酵母双杂交技术基础原理DNA基本技术专题知识第32页二、酵母单杂交系统需要构建“汇报”细胞酵母单杂交技术（yeastone-hybrid）由J.Li于1993年从酵母双杂交技术发展而来是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用一个方法;经过对酵母细胞内汇报基因表示情况分析,判别DNA结合位点并发觉潜在结合蛋白基因。DNA基本技术专题知识第33页酵母单杂交技术基础原理DNA基本技术专题知识第34页三、蛋白质-RNA相互作用也可采取酵母三杂交系统进行分析酵母三杂交系统（yeastthree-hybridsystem）于1996年由D.J.SenGupta