DNA的复制学习课件

验证半保留复制的实验一、Meselson-Stahl实验

二、Taylar实验

三、姐妹染色单体差别染色方法（sister-chromatiddifferentialstaining）

5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine，简称BUdR）斑色染色体（Harlequinchromosome）四、Cairns复制模型—θ型复制

图11-4Taylor蚕豆根尖放射自显影实验。

(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。第二节

复制的起点、方向和终点

一.研究方法：

1.用同位素标记电镜观察及变性法2.用噬菌体插入标记法同步培养不同步培养

3.变性定性法（denaturationmapping）

4.双向电泳法图11-11不同步培养时各标记的拷贝数不同

复制起点标记的拷贝数应最多二、原核的复制起点和方向

E.coli定点、双向对称复制。

T7在近一端的17％处开始，向两端延伸。枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组进行时双向复制。质粒ColE1有固定起始点，但却为单向复制。

mtDNA进行D（displacedloop）环复制

真核有多个复制起点（i），双向等速复制。D环复制第三节

DNA复制突变型的筛选根据温度敏感性筛选同位素标记法筛选5－溴尿嘧啶掺入法质粒温度敏感性的筛选根据抗药性筛选根据与突变有关的生物学功能筛选快停突变与慢停突变第四节

原核生物复制的酶系统DNA合成酶

DNA聚合酶的共同特点是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3'－OH；（3）合成的方向都是5’→3’;（4）除聚合DNA外还有其它功能。表11-1E.coli中的三种DNA多聚酶

DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ结构分子量

109KD90KD900KD构成

单体单体异多聚体分子数/细胞

400？10-20酶活性：5→3`聚合酶

+++3`→5`外切酶

+++5`→3`外切酶

+－－(可切单链)突变体突变位点polApolBpolC(dnaE),dnaN,dnaZX,dnaQ,dnaT突变表型修复有缺陷能修复阻止复制

(一).DNA聚合酶I的结构DNA聚合酶有6个结合位点：(1)模板结合位点；(2)引物结合位点；(3)引物3’－OH结合位点；(4)底物dNTP结合位点；(5)5’→3’外切酶结合位点；(6)3’→5’校正位点。(二).DNA聚合酶Ⅰ的功能

1.5’→3’聚合功能

2.3’→5’外切活性

3.5’→3’外切活性

(1)切口平移（nicktranslation）；

(2)链的置换；

(3)模板转换（template-switching）

4.内切酶活性(三)DNA多聚酶Ⅲ的结构全酶在DNA上的装配分为三个阶段：（1）一个β二聚体加上一个γ复合体识别引物模板形成一种前起始复合物。（2）DNA在于β,γ复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和。使核心酶能与DNA结合。（3）τ二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。二.DNA连接酶其作用机制是分三步进行：1.在真核生物中，E＋ATP→E－AMP＋ppi

在E.coli中，E＋NAD→E－AMP＋NMN（烟酰胺单核苷酸）2.E-AMP上的AMP转移到DNA的5’-PO4上使其活化3.活化的5’－PO4与相邻的3’－OH作用形成3’－5’磷酸二酯键，并释放出AMP。三.单链结合蛋白（SSB）又称为双螺旋去稳定蛋白（helixdestabilizingprotein）由177个aa组成在E.coli中以四聚存在分子量为74KDa在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。（1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。四.解旋酶(helicase)第五节原核生物，噬菌体和病毒的复制

起始和终止一.环状DNA的复制复制起始区的结构特点是：（1）富含A－T，这可能和双链易于解开起始复制有关；（2）含有多个回文结构（9－14个GATC）8个GATC较保守,CATC中的“A”已甲基化;（3）具有4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；（4）此顺序的右侧毗邻区域有两个启动子，其可能的作用是：①转录产生引物；②产生复制必要的蛋白；③产生调节功能的RNA；④起转录激活作用。

1968年Gilbert提出滚环复制模型:（1）共价延伸；（2）模板链和新合成的链分开;（3）不需RNA引物，在正链3‘－OH上延伸（4）只有一个复制叉;（5）形成多联体（concatemer）;

滚环复制的电镜照片

哪些DNA进行滚环复制?真核rDNA的扩增；F因子DNA的转移；λ裂解途经的复制；φX174,M13.G4等；单链环状DNA噬菌体第二阶段复制都是进行滚环复制的。二.DNA末端起始复制线性双链DNA的复制有的是从一端开始的:腺病毒（Adenovirus）φ29DNAs脊髓灰质病毒（poliovirus)腺病毒DNA全长35937bp，线性双链，两端各有反向重复顺序103～162bp，两末端各有50bp为复制起点。其复制是以单链置换（stranddisplacement）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。三.复制的终止E.coli的复制终止现已发现有两个终止区域（terE,D,A和terC,B），位于相遇点的另一侧100Kb处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。ter顺序有一个23bp的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性。终止需要tus(terminusutilizationsubstance)基因的产物Tus(36kD)，Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进。ter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来实行终止。第六节复制的过程一.半不连续复制E.colidUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。以下实验证实了这个解释：(1)在dut-突变体（dUTPase缺失）中冈崎片段比在dut+中为短。这是因为U掺入机会增加；(2)在ung-

（尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突变体中，新合成的DNA约有一半由片段组成。(3)因为尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不会切除U的糖苷链，也就不会出现AP位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保持了半不连续的原貌。在dut-,ung-双突变体中，结果和实验（2）相同，更进一步证实了此推测。酵母的自主复制区ARS(autonomouslyreplicationgsequence)发挥复制起点的功能，但是过量的；酵母染色体Ⅳ的着丝粒附近为ARS1序列；ARS1分为A,B,C三个功能区,A,B起主要作用,C起次要作用；A区为15bp,其中11个保守，称ACS

(ARSconsensussequence)。有复制起始子的功能；B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区；B3是ABF1（ARS-bindingfactor1）结合区。酵母的复制ORC：由6个亚基组成相当于DnaA和λ的O蛋白，与A/B1结合，结合于游离的DNA

Cdc6:相当于DnaC,及λ的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体上。此对在Origin上起始复制是必须的。Mcm:DnaB螺旋酶。即licensingfactorABF1（转录因子）结合于B3原核和真核生物复制体系的比较E.coliλ

SV40/人酵母功能

DnaAOT抗原ORC起始蛋白

DnaBDnaBT抗原MCM解旋酶

DnaCP?Cdc6装配因子

DnaGDnaGPolα-引发酶Polα-引发酶引发酶

PolⅢ的α亚基PolδPolδ,Polε聚合酶

PolⅢ的ε亚基PolδPolδ,Polε校正

PolⅢ的

亚基PCNAPCNA滑动钳复合体RF-CRF-C滑动钳装配器

SSBRF-ARF-A单链结合蛋白Pvu

Bg1BamH1BampBR322TELTEL四膜虫rDNAARS

PvuBg1

BamH

连接

Pvu转化酵母

Pvu传几代酵母DNAPvuPvu

连接

转化酵母传几代