高效液相色谱法分离和测定小麦中的5种内源激素

高效液相色谱法分离和测定小麦中的5种内源激素张玉琼;仲延龙;高翠云;董召荣;陈娜;王梅方【摘要】Ahighperformanceliquidchromatographic(HPLC)methodwasdevelopedtodeterminethefiveendogenoushormonesincludingindole-3-aceticacid(IAA),abscisicacid(ABA),gibberellicacid(GA3),zeatin(ZT)andsalicylicacid(SA)inwheat.Theseparationconditionswereoptimized,andmethanolwaschosenastheextractionsolvent.Thentheextractwasextractedbypetroleumetherandethylacetate,andpurifiedwiththeSep-PakC18column.Thechromatographicconditionswereasfollows:EclipseXDB-C18reversedphasecolumn(250mmx4.6mm,5”m),theflowrateof1mL/min,theinjectionvolumeof10“L,andthedetectionwavelengthof240nmwereusedfortheseparationofSAfrom14.5minto18min,whilethedetectionat254nmusedfortheseparationoftheothers.Methanol(A)andaceticacidaqueoussolution(pH3.6)(B)wereusedasthemobilephaseswiththelineargradientsetasfollows:0-7min％20A,7-10min20％A-28％A,10-17min28％A,17-19min28％A-40％A,19-35min40％A.Theresultsshowedthat:thehormoneswereseparatedwellwiththerecoveriesof96.9％-98％,andtheRSDswereintherangeof1.5％4to2.29％.Itisareliablemethodforrapid,accurateseparationanddeterminationoftheendogenoushormonesinwheat.% 建立了高效液相色谱法(HPLC)用于分离和测定小麦中的吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、玉米素(ZT)和水杨酸(SA)5种植物内源激素.经过条件优化,选用甲醇作为样品提取溶剂.然后,经石油醚和乙酸乙酯萃取，经Sep-PakC18小柱纯化.液相色谱的分离采用EclipseXDB-C18(250mmx4.6mm,5pm)反相色谱柱；流速为1mL/min;进样量10pL.检测器波长设置为254nm;14.5min时切换到240nm;SA洗脱后即18min时切换回254nm.流动相A为甲醇,B为乙酸溶液(pH3.6)•梯度条件为0~7min,20%A;7~10min,20%A~28%A;10~17min,28%A;17-19min,28%A~40%A;19~35min,40%A•结果表明，小麦中各激素的分离效果理想，加标回收率达96.9%~98%相对标准偏差在1.54%~2.29%之间•因此，该方法的建立为快速、准确地分离和测定小麦内源激素提供了可靠的方法.期刊名称】《色谱》年(卷),期】2013(031)008【总页数】4页(P800-803)【关键词】高效液相色谱法;内源激素;小麦【作者】张玉琼;仲延龙;高翠云;董召荣;陈娜;王梅方【作者单位】安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036;安徽农业大学农学院,安徽合肥230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036【正文语种】中文【中图分类】O658植物激素对植物的种子萌发、生长、开花、成熟、衰老、休眠等生命活动起直接或间接的调节、控制作用［1，2］。小麦是我国三大农作物之一，如何调控其生长发育，进而促进分蘖，提高产量和品质，备受农业科研人员的关注。了解小麦内源激素的变化规律，对于研究其产量和抗性等具有重要的生产实践价值［3-5］。植物内源激素含量的测定方法主要有酶联免疫、同位素标记和高效液相色谱等。其中高效液相色谱法具有重现性好、分辨率和灵敏度高、分析速度快等优点，近几年应用逐渐增多［6-8］；其中各种激素分别检测较多［9，10］，虽然效果好，但耗时较长。为了快速分离、检测植物中的多种内源激素，应优先考虑多种激素的同时检测。内源激素在体内含量甚微，种类复杂，结构各异，对温度等条件敏感［11］。如吲哚乙酸（IAA）和玉米素（ZT）属于生物碱，赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）是萜类化合物，水杨酸（SA）属于酚酸类，使用HPLC同时检测，难以实现每种物质都很好分离的效果［12］。因此有必要对HPLC方法进行优化同时，选择合适的提取方法也是关键［13］。恰当的预处理有利于激素的富集和干扰物质的去除。目前，关于小麦内源激素的提取、分离、测定方法相对较少。尤其近年来被认为是一种新的植物激素的物质——水杨酸（SA）［14］的高效液相色谱法测定鲜有报道。本实验从洗脱液梯度、pH和检测波长的切换等方面对激素分离条件进行优化，对小麦中的IAA、ABA、GA3、ZT、SA进行分离和测定，建立一种分析小麦激素的有效方法，从而为小麦内源激素调节和控制小麦的生长、衰老等研究提供关键技术。1实验部分仪器与试剂Agilent1200高效液相色谱仪，Agilent1200系列泵，可变波长检测器，TU1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），320-SpH计（MettlerToledo）,HR-120电子天平（A&D公司），KQ500DE型超声波脱气，BeckmanAllegra64R冷冻离心机。玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸、水杨酸标准品（Sigma公司，纯度＞99%）,甲醇、乙酸（色谱级，美国Tedia公司），石油醚、乙酸乙酯（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），实验用水为超纯水。所有试剂在使用前均用0.45pm微孔滤膜过滤。标准溶液的配制用甲醇配制0.2g/L生长素、0.1g/L玉米素、0.1g/L脱落酸、2.5g/L赤霉素、0.4g/L水杨酸的混合标准溶液。样品前处理按参考文献［15］的样品处理方法并予以改进和优化。称取新鲜小麦叶2g、根5g，分别加入10mL预冷的80%（如无特殊说明均为体积分数）甲醇，冰浴研磨成浆，保鲜膜密封后于4工冷浸过夜。然后于4工条件下以8000r/min离心10min得上清液，残渣加入8mL80%的冷甲醇离心10min后合并上清液。全部滤液于40工下减压浓缩至原体积的1/3,加入30mL石油醚萃取脱色3次，弃醚相。水相用20mL乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，40°C下减压蒸干。加入pH3.5的乙酸溶液2mL,过Sep-PakC18小柱纯化，用甲醇洗脱，收集后在40°C下减压浓缩至干。用流动相溶解并定容至2mL,经0.45pm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。色谱条件色谱柱为EclipseXDB-C18（250mmx4.6mm,5pm,Agilent公司），流动相A为甲醇，B为乙酸的水溶液（pH3.6），梯度条件为0~7min20%A,7~10min20%A~28%A,10-17min28%A,17-19min28%A~40%A,19-35min40%A。流速为1mL/min，进样量为10pL。检测器波长设置为254nm;14.5min时切换到240nm;SA洗脱后即18min时切换回254nm。检测温度为室温。2结果与讨论样品处理条件的优化在小麦生长发育过程中，植物内源激素含量甚微，且与其他各类物质并存，应用HPLC检测时，不可避免地相互干扰，呈现分离效果差等现象。因此，如何有效减少杂质是激素提取的关键。分别以水、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚作为溶剂，发现甲醇的提取率高、杂质较少。采用甲醇为提取溶剂，分别设置浸提时间为8、12、16、20、24h。小麦中玉米素、水杨酸和赤霉素等激素的提取效率随提取时间的延长而升高，16h以后达到较高水平，再延长时间增加不明显。经石油醚脱色和乙酸乙酯萃取后，杂质的干扰依然较大，因此选择进一步纯化处理。参照文献[15,16]的样品处理方法，过聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）柱、Sep-PakC18小柱进行纯化，结果发现检测不出水杨酸。由于水杨酸含量低且易被PVPP吸附，因此选择过Sep-PakC18小柱纯化。实验结果表明，5种激素提取效果良好。色谱条件的选择2.2.1流动相梯度以甲醇（A）-水（B）两相作为流动相，选择不同比例的流动相对激素进行分离。用等度洗脱进行最适条件摸索，分别设定甲醇（A相）为15%、17%、20%、23%、26%、28%、35%、40%。结果发现当甲醇含量高于20%时，玉米素在2~3min洗脱出来，容易与样品中的杂质峰重叠；而甲醇含量低于20%时，出峰时间过晚，检测时间变长；甲醇含量为20%时，其他激素峰拖尾严重。经过优化，发现当甲醇含量上升到28%时，GA3和SA的分离度高；当升高到40%时，IAA和ABA的分离效果好。综合考虑各激素分离度、峰形的对称性以及缩短分析时间，最终采用1.4节所述的梯度洗脱条件。2.2.2流动相的pH乙酸可以抑制样品的解离，改善峰拖尾现象，因此在流动相中加入乙酸。不同浓度的乙酸对样品的分离也有较大影响。分别用pH3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0的乙酸溶液进行试验。结果显示当pHv3.6时，出峰时间过早，易于与样品中的杂质峰重叠，干扰实验结果。当pH提高时，各激素保留时间也相应变长。而当pH3.8时，赤霉素与水杨酸峰部分重叠。当pH达到4.0时各激素的保留时间延长，检测时间也相应增加。因此，选择pH3.6的乙酸的水溶液为流动相B，各峰的分离度以及保留时间都较好。检测波长在190-400nm范围内，用紫外可见分光光度计扫描混合标准溶液。各激素的最大吸收波长分别为：IAA,250nm;ABA,246nm;GA3,210、255nm;ZT,262nm;SA,240nm。参照文献［17］方法，在254nm波长下对激素的标准品及样品进行测定并在GA3出峰前将检测波长切换到210nm（GA3的最大吸收波长）。结果发现，由于210nm与甲醇的最大吸收波长接近，GA3峰形较差；而254nm虽然不是GA3的最大吸收波长，但是在此波长下其吸收值较高，而且可以有效避免与流动相的干扰。因此首先以254nm作为激素的检测波长，在此波长下SA的响应值低、峰形差（图1a）。而切换波长更利于待测组分的分析检测，因此选择在SA出峰前（14.5min）将检测器波长切换到240nm，待出峰完全结束后（18min）切回254nm（图1b）。流速图1在（a）254nm和（b）切换波长检测条件下的小麦叶色谱图Fig.1Chromatogramsofwheatleafsamplesunder（a）254nmand（b）switchingUVwavelengthsPeaks：1.zeatin（ZT）;2.gibberellicacid（GA3）;3.salicylicacid（SA）;4.indole-3-aceticacid（IAA）;5.abscisicacid（ABA）.分别考察了流速为0.6、0.8、1.0、1.2和1.5mL/min时的分离效果。当流速小于1mL/min,检测时间延长；当流速为1.2或1.5mL/min，赤霉素和水杨酸的色谱峰重叠，分离效果差。流速为1mL/min时，各激素能在35min内很好的分离。在优化的色谱条件下，对混合的标准样品进行检测。从图2中可以看出，5种激素能够较好地分离和检出。图2混合激素标准品的色谱图Fig.2ChromatogramofthemixtureofhormonesstandardsPeaks：1.ZT；2.GA3；3.SA；4.IAA；5.ABA.标准曲线及其线性范围以5种激素的标准溶液为原液进行逐级稀释，在优化的色谱条件下分析。以峰面积为纵坐标（y）,质量浓度为横坐标（x,mg/L）,计算各内源激素的回归方程、相关系数和线性范围，同时按3倍信噪比得到各激素检出限（见表1）。由结果可知,标准品浓度与峰面积的相关性良好。表15种激素的线性关系和检出限Table1LinearrelationshipsandLODsofthehormonesHormoneRegressionequationCorrelationcoefficientLinearrange/（mg/L）LOD/（mg/L）ZTy二51.40x+0.58970.99990.39125.00.195GA3y=44.65x+2.8170.99940.488-62.50.208SAy=29.34x-5.5750.99941.95-31.30.976IAAy二39.03x+16.370.99890.391-12.50.300ABAy二64.24x+6.9330.99960.318-4.680.195回收率的测定和实际样品分析取小麦根样品2g，按照1.3节方法制备样品并用上述条件进行测定。如图3所示，小麦根中的激素能得到很好的分离。随后进行加标回收试验,结果见表2。图3小麦根样品的色谱图Fig.3ChromatogramofwheatrootsamplePeaksarethesameasinFig.2.表2各激素的加标回收率（n二5）Table2Spikedrecoveriesofthehormones(n=5)HormoneSamplecontent/(mg/L)Added/(mg/L)Meanrecovery／%RSD／%ZT1.525.098.01.89GA37.601097.81.65SA4.955.097.81.93IAA5.181096.92.29ABA1.105.097.61.54测定孕穗期小麦样品中的激素含量，结果显示小麦叶中含玉米素0.962pg/g、赤霉素2.54pg/g、水杨酸2.80pg/g、生长素0.523pg/g、脱落酸0.736pg/g。小麦根中含玉米素1.10pg/g、赤霉素1.36pg/g、水杨酸0.480pg/g、生长素0.377pg/g、脱落酸0.503pg/g。3结论通过优化小麦中5种内源激素的提取条件以及色谱条件，建立了一种简单、有效的高效液相色谱分析方法。分离效果理想，加标回收率达96%~98%，检出限为0.195-0.976mg/L。方法满足激素定量分析的测定要求，为进一步检测小麦生长过程中内源激素的变化、激素代谢与小麦的生长、衰老等相关性研究提供了关键技术。参考文献：MaggioA，BarbieriG，RaimondiG，etal.JPlantGrowthRegul，2010，29：63LiuHT，LiYF，LuanTG，etal.Chromatographia，2007，66：515[3]ZhangSL,LiZQ.JournalofWheatResearch(张酸亮，李赈群.小麦研究)，1996，17(3)：33ZhaoCJ，KangSJ，WangJH，etal.ActaAgriculturaeBoreali-Sinica(赵春江，康书江，王纪华，等.华北农学报)，2000，15(3)：51HeJL,LiuHX.JournalofTropicalandSubtropicalBotany(贺继临，刘鸿先.热带亚热带植物学报)，1998，6(4)：341LiuCJ,LiuYY,LiSQ,etal.FoodResearchandDevelopment(刘长江，刘旸旸，李书倩，等.食品研究与开发），2012，33（2）：162TangY，WangL，MaC，etal.JournalofLifeSciences，2011，5：139YangTX，WeiAZ，ZhengY，etal.ChineseJournalofAnalyticalChemistry（杨途熙，魏安智，郑元，等•分析化学），2007,35:1359FuJH，ChuJF，WangJD，etal.ChineseJournalofAnalyticalChemi