时间分辨培训

时间分辨荧光免疫分析技术

培训上海新波生物技术有限公司问题时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。TRF的标记物及特点。为什么叫“时间分辨”?TRF在免疫分析方法学中的地位。标记免疫学发展历程放射免疫 （精度：10-12mol/L）酶联免疫 （精度：10-9mol/L）化学发光 （精度：10-15mol/L）电化学发光 （精度：10-17mol/L）时间分辨荧光（精度：10-18mol/L）生物芯片（未知）

待测物质浓度与检测手段

临床化学分析pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugs(药物浓度)ThyroidHormone(甲状腺激素)FertilityHormone(孕激素)CancerMarkers(肿瘤标记物)InfectiousDisease(传染病)Vitamins(维生素)SerumProteins(血清蛋白)10-1210-910-610-310-0各种免疫方法学的比较放射性免疫分析法（RIA）应用放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。缺点放射性（125I），对环境的污染及对身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）125I的半衰期短而导致其试剂有效期短。标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。操作繁琐，出报告时间长。无法保存备用。酶免疫分析法（ELISA）应用酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。试剂有效期较长。衍生技术：荧光酶免疫分析增强化学发光酶免疫技术曾经一度被认为是取代放免的检测手段。缺点灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好。化学发光免疫分析法（CLIA）应用单个样本检测速度快，适合做急诊。灵敏度较高。自动化程度高。仪器种类：拜耳—ACS180系列雅培—AXSYM贝克曼—ACCESS德普—IMMULITE缺点样品不能重复检测；出现故障则整批试剂及血样报废。本底较高，易受环境物质干扰。仪器故障率较高。标准曲线稳定性较差，需多次定标。检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足。非开放性试剂；试剂价格高。电化学发光免疫分析（ECL）应用80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。基本原理：根据三联吡啶钌[Ru(bpy)3]和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应。本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。缺点非开放性试剂系统、不能做科研。试剂价格过高。时间分辨荧光免疫（TRFIA）

（Time-ResoledFluoroimmunoassay）时间分辨荧光免疫的基本原理用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物质；当免疫过程结束后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的物理特点（Ⅰ特异性强、ⅡStokes位移大、Ⅲ寿命长），并采用解离-增强技术（ⅣDELFIA）放大有效荧光；最后用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据已知浓度所确定的标准曲线，来判断未知样品的浓度值，以达到定量分析的目的。乙肝表面抗原免疫反应图

（时间分辨荧光法）乙肝表面抗体免疫反应图

（时间分辨荧光法）乙肝ｅ抗原免疫反应图

（时间分辨荧光法）乙肝ｅ抗体免疫反应图

（时间分辨荧光法）乙肝核心抗体免疫反应图

（时间分辨荧光法）时间分辨荧光免疫原理图

（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）光路图简介氙灯紫外滤光透镜分束器样品杯滤光片PMT负反馈标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、铽(Te)镧系元素荧光特点：荧光寿命极长镧系元素螯合物（60~900us)<铕：714us>普通荧光免疫中荧光团：1~100ns样本中蛋白质荧光：1~10ns，易猝灭。Stokes位移大（大约290nm）铕：发射光613nm、激发光340nm，荧光素的Stokes位移为28nm荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615±5nm）解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使本底达到0利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光。而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的又一保障发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。DELFIA技术为临床检测带来的先进性技术特点检验先进性时间分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发荧光分离０背景、高特异性解离-增强荧光性大大提高稳定的荧光螯合物线性范围更宽重复性更好原子标记

标记位点多，可达20个对标记物结构及活性影响小无衰变受环境影响小高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长同一批次只需两点定标多标记单，双，三，四标记同一试剂盒可同时测多个项目不同标记物的波长0.5125102050100200500 U/L51002000Cps.103时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标DELFIAhFSH标准曲线稳定，试剂保质期长N=6时间分辨荧光免疫的试剂种类甲状腺功能检测TSH，UltraTSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TG性激素类检测FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG肿瘤标记检测AFP，CEA，CA-153，CA-125，CA-199遗传科检查产前筛查：hAFP/

HCG，PAPPA新生儿筛查：Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OHProg，PKU传染病检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HBcAb-IgM、HCV、HIV、TP血液科检测贫血检查：Ferritin，VitB12，Folicacid科研工具单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测时间分辨荧光免疫---突出优点零本底、灵敏度高线性范围宽试剂有效期长标准曲线稳定性好易于自动化TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。公司简介上海新波生物技术有限公司是一家新近成立于上海浦东张江高科技开发区的高新技术企业，是国际上少数几家掌握“时间分辨荧光免疫”检测技术的厂家之一。新波生物致力于这一新技术的研究，现已在方法学研究、试剂合成、标记物的制备、抗原抗体纯化、检测仪器的生产等方面均取得了很大成果。2000年在国内首家推出了ANYTEST2000型时间分辨荧光免疫检测系统，并列为上海市高新技术项目；与此仪器配套的试剂种类多达82种，其中58项用于临床检验、24项用于科研。半自动ANYTEST2000Anytest2000时间分辨检测仪ANYTEST2000主要特点试剂的多样性种类多达82种，其中临床58项、科研24项每年推出新诊断试剂盒（根据客户不同需求而开发）

仪器的先进性

高灵敏度：10-18mol/L（Eu3+）线性范围宽：10-13mol/L～10-18mol/L高稳定性：＜±1%快速测试：1秒／样标本量灵活：适合每天1～400份标本量适用范围：各类大小型的医院、生化实验室应用于临床检测和科学试验标准曲线、测试数据长期保存、共享智能化操作软件

价格的可比性

进口试剂国内分装——价格与进口酶标试剂可比性专为中国设计的仪器——价格与进口γ计数仪的可比性ANYTEST2000智能化操作界面友好的主界面简洁的操作过程强大的数据处理时间分辨法检测“乙肝五项”的意义原子标记、灵敏度高，有效区分弱阳性与阴性血样。二步法的采用，最大限度避免HOOK现象出现。（强阳性血样检测为阴性）定量检测可以动态观察治疗效果。量化评估乙肝疫苗接种效果。结果准确、价格