环境微生物的分离和分离纯化和鉴定

环境中微生物的分离、纯化及鉴定实验目的掌握利用平板分离法从环境中分离微生物的基本操作;学习微生物的分类鉴定技术实验材料和方法以分离有机磷农药降解菌株为例：实验材料:菌源:长期受有机磷农药污染的土壤培养基:基础盐培养基：磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.1g，硫酸亚铁0.1g，氯化钠1.0g，去离子水1000ml，pH7.0。降解菌株的富集、培养取长期施用有机磷农药的污染土壤10.0克，置于100mL富集培养基（以100mg/L有机磷农药为唯一碳源的基础盐培养基）中，于30℃，120rpm摇床培养1d。取适量菌液接入同样培养基中，30℃培养，反复转接。0.9`0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.9ml分离纯化基本流程平板稀释法将富集的菌液涂布在含有100mg/L有机磷农药的无机盐固体培养基上。培养将细菌培养基倒置于30oC培养箱中培养1-2d;挑菌（纯化）挑取能在有机磷农药的平板上产生水解圈的菌落。纯化分离将单菌落于平板上多次划线分离，只至菌体形态单一，大小一致（也可以用显微镜涂片染色镜检是否是单一的微生物）.如有杂菌需进一步纯化、分离。1.生理生化、形态学鉴定(略)2.16SrRNA基因序列分析鉴定菌落和菌体形态：革兰氏染色（初染、媒染、脱色、复染）生理生化鉴定鉴定参考《常见细菌鉴定手册》和《Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology》。1.生理生化、形态学鉴定(略)生理生化鉴定V.P.反应(葡萄糖蛋白胨水培养基)（蛋白胨5g，K2HPO42g，葡萄糖5g，水1000ml，pH7.6121/30min灭菌）利用葡萄糖氧化、发酵产酸（商品化的糖发酵管）吲哚试验（蛋白胨水培养基）（蛋白胨10g，NaCl5g，水1000ml，pH7.6121/30min灭菌）水解淀粉（淀粉平板）（蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，可溶性淀粉2g，水1000ml，琼脂18g，pH7.2121/30min灭菌）需氧情况：最适pH：最适温度：注：+，阳性反应；-，阴性反应V.P试剂、吲哚试剂、卢戈氏碘液(淀粉水解试验)16SrRNA基因序列分析菌体总DNA的提取采取SDS高盐沉淀法。菌株活化后接5mL试管，于30℃剧烈振荡培养过夜，10%接种量转接至50mLLB液体培养基培养至稳定期。离心收集菌体，等体积TEN洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于10mLTEN中，加入200μL溶菌酶（100mg/mL），37℃水浴1h，加入50μL蛋白酶K（19mg/mL），再加入500μL20%的SDS，37℃水浴过夜。加入1/3体积饱和NaCl剧烈振荡，12000rpm离心5min，上清用等体积酚：氯仿抽提2次，12000rpm离心5min，收集上清，加入等体积TE，0.6倍体积异丙醇沉淀，挑取线状沉淀，70%乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后溶于200μLTE中。16SrRNA基因的PCR扩增引物为5'-agagtttgatcctggctcag-3'（E.coli8to27）和5'-taccttgttacgactt-3'（E.coli1507to1492）。50μl反应体系：模板100ngdNTP(2.5mM)4μl引物（25pmol/μl）各1μlBuffer(10×)5μlMg2+(2.5mM)3μlrTaq酶0.5μlH2O35.4μl反应条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸3min，共循环30次，后72℃延伸10min；4℃保温。

图

16SrRNA基因PCR扩增片段电泳图谱ADNAmarker(DL2000)B,C16SrRNA基因PCR产物16SrRNAgene序列AAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGATCCTTCGGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTGGGTTCGGAATAACGTTTGGAAACGAACGCTAATACCGGATGATGACGAAAGTCCAAAGATTTATCGCCCATGGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCTAGTTGGTAAGGTAAAGGCTTACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCACGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCGATTTAAGTCAGGGGTGAAAGCCGAGTGCTCAACACTGGAACTGCCTTTGAGACTGGATTGCTTGAATCACGGAGAGGTGGGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCCACTGGACGTGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGCTGGGGTGCATGGCATTTCAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACGTTTGACATCCCTATCGCGGATCGTGGAGACACTTTCCTTCAGTTCGGCTGGATAGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGACTTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGTACTCTAAAGTAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGACTACAGTGGGCAGCCACTCCGCGAGGAGGAGCTAATCTCCAAAAGTCGTCTCAGTTCGGATCGTTCTCTGCAACTCGAGAGCGTGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGATTCACTCGAAGGCGTTGAGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCGACCACAGTGGGTTTAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCGenBank登录号获得菌株部分长度的16SrRNA基因序列将其序列通过Blast程序与RDP或GenBank中核酸数据进行比对分析（http://），采用ClustalX进行精确比对，邻接法构建进化树。系统进化树的绘制

Paracoccussp.R-2

Paracoccusaminovorans(T)D32240

Paracoccusyeei(T)AY014173

Paracoccusthiocyanatus(T)D32242

Paracoccusdenitrificans(T)Y16927

Paracoccusaminophilus(T)D32239

Paracoccusalcaliphilus(T)D32238

Paracoccusseriniphilus(T)AJ428275

Paracoccuscarotinifaciens(T)AB006899

Paracoccushaeundaensis(T)AY189743

Paracoccusalkenifer(T)Y13827Paracoccussolventivorans(T)Y07705

Paracoccuskocurii(T)D32241

Paracoccuskoreensis(T)AB187584

Paracoccuspantotrophus(T)Y16933Paracoccusversutus(T)D32243

Paracoccuszeaxanthinifaciens(T)AF