骨骼肌的原代培养法

骨骼肌的原代培养一.试剂1.包被用多聚赖氨酸poly-lysine的配制与包被1）准备0.94%硼酸溶液称取0.94硼酸粉末溶于80ml水中，用NaOH将pH值调至8.4,再定容。2） 按每4.9mg多聚赖氨酸粉末溶解于98ml0.94%硼酸溶液配制100ml.3） 0.22卩M过滤分装，-20°C储存，避免反复冻融。4） 包被：按10cm皿用4ml包被液进行包被，4°C过夜或37°C2小时后，吸干，回收包被液，包被过的皿置4°C保存可达一个月，临用前用PBS或灭菌的去离子水洗3遍再使用，整个包被过程均为无菌操作。多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。多聚赖氨酸包被培养板使用前是用灭菌的去离子水稀释，最好不要用双蒸水或别的，因为多聚赖氨酸包被的原理是通过改变器皿表面的电荷而促进细胞的黏附。0.1%I型胶原酶（1mg/ml）100mgI型胶原酶溶于100mlD-hank's液中，过滤后4°C保存。D-hank's液 （可以直接购买使用）KCl0.40g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g,NaHCO30.35g,NaH2PO4・7H2O0.09g，酚红0.01g。以上均为分析纯，加三蒸水定容至1L后高压灭菌，4°C分装备用；血清的灭活:常用的血清要先在56C水浴中灭活30min方可使用。灭活后-20C保存备用；细胞生长液的配制（100mL）:即含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液。取20ml灭活的血清,再加青、链霉素各100IU，然后用DMEM/F12培养基补充到100mL，4C保存备用。0.1%胶原酶II（100mL）的制备:称取胶原酶II100mg用100mLDMEM/F12液充分溶解，0.22卩M过滤后分装备用，-20C保存；75%乙醇Mini-Q（超纯水）--灭菌无离子水实验器械3、直剪和眼科剪6、15ml3、直剪和眼科剪6、15ml离心管4、眼科镊和止血钳5、烧杯三、正常小鼠原代骨骼肌细胞培养实验流程取肌肉于平皿，Hank's洗3次剔除脂肪、结缔组织肌肉标本剪约0.1cm3小块移至离心管，Hank's洗3次静置lmin,弃去上层液及漂浮组织0.25%胰酶，37度水浴消化20min,每5min摇动或吹打1次生长培养基终止消化，反复吹打，依次100，200,400目过筛亠J离心，1000rmp,10min,弃去上清重悬，计数细胞，接种密度以5x105个/ml悬液加入未经PPL包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度，1h转移包被瓶中，生长培养基培养，培养37°C,5%CO24d换液，以后每天换四、实验操作1、 新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hank's洗3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3小块；2、 将剪碎的肌肉移至离心管，Hank's洗3次，静置1min,弃去上层液及漂浮组织；3、 向上述离心管中加入0.25%胰酶，37度水浴消化20min,每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入生长培养基终止消化；4、 反复吹打后，依次100,200,400目过筛，滤液收集后，1000r/min离心10min；5、 弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经PPL包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度培养1h后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4d换液，以后每天换液1次。五、细胞鉴定1、显微鉴定：刚分离出的原代细胞比较小，呈球形，折光性强。12h后，细胞开始贴壁，72h后贴壁完全，细胞逐渐延展成梭形，随着培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向排列。当细胞融合80%以上后，开始形成肌管。2、 免疫细胞化学染色1：肌卫星细胞胞浆中含有结蛋白（desmin），可采用鼠抗人及小鼠desmin一抗对卫星细胞进行免疫染色鉴定。3、 免疫细胞化学染色2：采用骨骼肌特异性的肌球蛋白（myosin）单克隆抗体检测。取含骨骼肌细胞盖玻片常规处理后进行myosin的细胞免疫化学染色，PBS代替一抗做阴性对照。结果判定：以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。六、注意事项1、 胰酶消化过程中，也可采用15min两步消化的方法进行。根据所取组织个体年龄决定，一般成年大小鼠采用两步消化效果好，幼鼠一步消化和两步消化差别不大。2、 传代培养代数不要太多，骨骼肌细胞传代能力有限，容易死亡。3、 骨骼肌细胞培养过程中，形态会发生较大变化。4、 肌肉组织要尽可能剔除表面的膜和脂肪组织。四．猪骨骼肌卫星细胞的分离细胞培养瓶的包被吸取2.5ml的0.001%的L-多聚赖氨酸溶液加入25cm无菌培养瓶内，使液体覆盖培养瓶的生长面，然后室温静置3h以上,使用时将培养瓶取出，倾去其中液体，并用灭菌三蒸水冲洗2次,整个包被过程均为无菌操作。猪骨骼肌卫星细胞的分离1） 先将仔猪洗净后颈动脉放血致死，用75%酒精浸泡消毒，在无菌条件下分离背最长肌。2） 分离的肌组织块经D-Hanks液漂洗3次后，将其剪成lmm3左右大小的碎块.3） 再用D-Hanks液冲洗3次，静置5分钟后，弃去上层液体及漂浮组织，加入适量含0.1%胶原酶II的DMEM/F12培养基，吹打混匀后置于37°C、5%CO2的培养箱（美国SHELLAB沖进行消化20-24小时。约20-24小时后用吸管强力吹打使组织分散，再用100目、200目细胞筛依次过滤悬液，将滤液移入离心管中，1000RPM离心5-10分钟，去上清，细胞沉淀用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，在倒置显微镜下计数后，以不低于2x105/ml的密度接种在25cm2经L-多聚赖氨酸包被的培养瓶（比利时Orange）中，然后置于37C、5%CO2的培养箱中静置培养，隔天换液，并观察细胞的生长情况。待细胞贴壁且培养数天后，用0.25%的胰蛋白酶（含0.02%EDTA）37°C消化10分钟，加入适量含血清的培养基终止消化，柔和吹打细胞，使其脱离细胞瓶壁，将细胞重悬后采用差速贴壁法（3min左右）去除非成肌细胞，待成纤维细胞大多已贴壁，而骨骼肌卫星细胞仍处于悬浮状态时，将细胞悬液移出并重新接种在25cm平的培养瓶中，即为纯化的骨骼肌卫星细胞。培养1-2天后换液，在倒置显微镜下观察卫星细胞的增值、分化情况（参考王继新等（2002）方法）。猪骨骼肌卫星细胞的原代培养1） 将分离纯化的骨骼肌卫星细胞按lxlO5cell/mL的密度分别接种于10%和20%的胎牛血清培养基中。然后里于温度微37°C，饱和湿度，体积分数为5%CO2培养箱中培养，观察卫星细胞的贴壁、生长和分化情况。2） 待卫星细胞生长融合至70%时进行传代培养。即用0.25%的胰蛋白酶（含0.02%EDTA）37°C消化卫星细胞5~10分钟，然后加入适盆含血清的培养基终止消化，柔和吹打细胞，使其脱离细胞瓶壁，将重悬后的细胞按适当比例接种新细胞瓶，最后加入一定量的生长液，置于37°C、5%CO2的培养箱中静置培养。培养一天后换液，并观察卫星细胞传代培养的贴壁、增殖能力。五讨论：5.1骨骼肌卫星细胞的分离骨骼肌卫星细胞是一种位于肌纤维肌膜与基底膜之间的肌源性细胞。根据其特性己发展了很多分离方法，如机械分离、酶消化分离等，一般两者并用。胰酶适于消化细胞间质较少的软组织（如胚胎、肝、肾等），对纤维性组织及较硬的癌组织效果差，且较高浓度的胰酶对细胞生长也有一定的影响;而胶原酶则对细胞间质有消化作用，它适合消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，且胶原酶作用缓和，对细胞生长没有大的影响。故本试验采用胶原酶消化法，37C消化20-24h后，镜下即可见大量的卫星细胞被释放出来，获得了比较满意的分离效果。5.2骨骼肌卫星细胞的纯化骨骼肌组织中含有大量的杂质细胞，因而分离的卫星细胞里常混杂有许多非肌源性细胞，其中绝大多数为红细胞和成纤维细胞（图4-1）。红细胞不贴壁，可随换液而去除。但成纤维细胞与骨骼肌卫星细胞在形态上相似，不易区分。最早Yablonka-Reuveni（1987年）采用Percon进行不连续等密度梯度离心来分离非肌源性细胞和卫星细胞，这种方法所收集的卫星细胞纯度高，但细胞得率低，若需卫星细胞数量大时，则需花费大量的人力和物力。Webster等使用流式细胞仪筛选人骨骼肌卫星细胞，所得卫星细胞的纯度能达到99%以上，但需要针对某种类动物卫星细胞的单克隆抗体。本试验采用差速贴壁法，在接种30min-lh后，待成纤维细胞大多已贴壁，此时将细胞悬浮移出进行第2次接种，即可获得大量均一的骨骼肌卫星细胞。4.3骨骼肌卫星细胞的原代培养经差速貼壁法（30min）纯化后的卫星细胞呈01球形，折光性强.经台盼兰染色显示其成活率在90%以上口培养12h后有部分卫星细胞产始贴壁（图4-2）t2天后绝大多数卫星细胞就已贴壁并生长成梭形或纺锤形的单如细胞.随着培