31DNA重组技术的基本工具上课

专题1基因工程一、基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子程度人类需求的生物类型和生物产品剪切→拼接→导入→表达基因重组指按照人们的愿望，进展严厉的设计，并经过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而发明出更符合人们需求的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子程度上进展设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。记一记

1.1DNA重组技术的根本工具3DNA重组技术的根本工具工欲善其事,必先利其器.想一想:获得转基因抗虫棉需求做哪些任务呢?实现这一准确的操作过程的工具是什么呢?

1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀〞(1)来源:(2)化学本质：

(3)作用

(4)作用特点：(5)切割方式识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。错位切：产生两个一样的黏性末端平切：构成平末端特异性，即识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。主要从原核生物蛋白质T磷酸二酯键1234512345A7限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称反复陈列的。图1-1限制酶识别序列的中心轴线当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。黏性末端当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。EcoRI限制酶的切割：中轴线黏性末端黏性末端在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。平末端当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。CCCGGGGGGCCCSmaI限制酶的切割：只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线要想获得某个目的基因必需求用限制酶切几个切点？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切点，产生四个黏性末端，两个。假设把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生一样的黏性末端。是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?实践还不够,还需求DNA衔接酶进展衔接。思索题：2、ＤＮＡ衔接酶——“分子缝合针〞种类：作用部位：E·coliDNA衔接酶〔黏性末端〕T4DNA衔接酶〔黏性末端和平末端〕是磷酸二酯键，将双链DNA片段“缝合〞起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,这样一个重组的DNA分子就构成了。不是氢键。E·coliDNA衔接酶与T4DNA衔接酶比较：类型来源E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能衔接黏性末端能衔接黏性末端和平末端(效率较低)一样点差别DNA聚合酶和DNA衔接酶有何一样点和不同点？DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链连接部位相同点双链单链在两DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羟基上，构成磷酸二酯键都能构成磷酸二酯键二者都由蛋白质构成记一记DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点DNA衔接酶与DNA聚合酶1)只能将单个核苷酸衔接到已有的核酸片段上，构成磷酸二酯键构成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间构成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸经过磷酸二酯键衔接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时衔接起来，不需求模板限制酶解旋酶区别限制性内切酶与解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键翻开构成两条单链据右图所示，有关工具酶功能的表达不正确的选项是〔〕A.限制性内切酶可以切断a处，DNA衔接酶可以衔接a处B.DNA衔接酶可以衔接a处C.解旋酶可以使b处解开D.衔接b处的酶可以为DNA衔接酶D3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车〞〔1〕载体的作用将外源基因转移到受体细胞中去。运载体对外源基因进展大量复制。〔2〕作为载体必需具备的条件可以在宿主细胞中自我复制并稳定地保管。具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因衔接。具有某些标志基因，便于进展挑选。必需是平安的，不会对受体细胞有害。大小应适宜，便于提取和操作记一记〔3〕常用的载体质粒λ噬菌体衍生物动植物病毒常用的载体：质粒复制起始的一段序列有切割位点有标志基因的存在，可用含氨苄青霉素的培育基鉴别质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物细胞中。是一种裸露的、构造简单、独立于细菌拟核DNA或细胞核之外自我复制的很小的双链环状DNA分子不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制〔〕B、有多个限制酶切点C、具有标志基因D、它是环状DNAD议一议2、能否用SARS病毒作为基因载体？3、作为载体，假设没有切割位点将怎样？4、携带目的基因的载体能否进入了受体细胞，如何鉴定？5、假设目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？双链DNA不能不能进展DNA的重组载体上应有标志基因能够呵斥基因丧失思索与探求1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割构成的DNA片段：(1)…CTGCA

(2)…AC

(3)GC…

…G

…TG

CG…〔4〕…G

(5)

G…

(6)…GC

…CTTAA

ACGTC…

…CG(7)GT…

(8)AATTC…

CA…

G…他能用DNA衔接酶将它们衔接起来？2和7能衔接构成…ACGT…

…TGCA…；4和8能衔接构成…GAATTC…

…CTTAAG…；3和6能衔接构成…GCGC…

…CGCG…；1和5能衔接构成…CTGCAG…

…GACGTC…。272、为什么限制酶不能将本人的DNA分子剪切掉？1、DNA分子不具备该种限制酶的识别切割序列；2、经过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能切开。4.网上查询：DNA衔接酶有衔接单链DNA的身手吗？迄今为止，所发现的DNA衔接酶都不具有衔接单链DNA的才干，至于缘由，如今还不清楚，也许未来会发现可以衔接单链DNA的酶。29真核生物的基来由编码区和非编码区组成，两边是非编码区〔非编码序列〕、中间是编码区〔编码序列〕。而中间的编码区也由编码序列和非编码序列相间陈列组成，其中的编码序列称外显子、而非编码序列称内含子。原核生物的基因也有编码区、非编码区，但是编码区内是延续的编码区列。〔留意在原核生物基因中，没有外显子和内含子的概念，即他不能说原核生物的编码区全是外显子〕这样的基因转录是，先以编码区其中一条链为模板合成mRNA，这就是前体mRNA，然后有些酶将那些内含子对应的序列切去，把外显子对应的mRNA的序列链接在一同，这就是成熟的mRNA，这就是翻译蛋白质的直接模板了。核糖体结合在上面，并沿其滑动。当遇到AUG〔真核生物的起始密码子〕或者GUG〔原核生物的起始密码子〕时，肽链的合成开场，当遇到UAA、UAG、UGA〔终止密码子〕的时候，肽链合成终止。一句话：编码区〔外显子、内含子〕和非编码区是基因的构造。起始、