第10章-人工种子和种质资源

第十章人工种子和种质资源离体超低温保存第一节人工种子第二节种质资源离体超低温保存第一节人工种子一、人工种子的概念及研制的意义二、植物体细胞胚胎发生及其同步性技术的研究三、人工种皮的研制四、人工胚乳的研制五、人工种子包埋方法六、人工种子的应用前景一、人工种子的概念及研制的意义1、人工种子的概念

指将植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包埋在含有营养物质和具有保护功能的人工胚乳和人工种皮中所形成的在适宜条件下能发芽出苗的颗粒体。

2、人工种子研制的意义（1）不受季节限制，利用人工种子技术,大量、快速繁殖性状优良、遗传性稳定的植物种和品种。（2）大量繁殖无病毒材料，以提高植物抗性、产量和商品品质。制作人工种子时还可加入菌肥、微生物、农药，以抵抗外来病毒和微生物的浸染。（3）对生育周期长的多年生植物（果树、观赏树木、林木）；育性不良的难于有性繁殖的植物（甘薯、球根和宿根花卉、芋类等）可用人工种子技术进行繁殖；遗传性不稳定的杂交F1代无需等待其稳定，可用人工种子技术繁殖，性状优良者直接应用于生产。（4）人工种子体积小，贮藏运输方便。（5）人工种子如天然种子一样，具有坚硬的种皮，适于机械化播种二、植物体细胞胚胎发生及其同步性技术的研究

制作人工种子，首先要求能够同步地、大规模地产生成熟的体细胞胚状体。但体细胞胚胎发生中的一个普遍现象，即胚状体发生的不同步性，常常在同一外植体上观察到不同发育时期的大大小小的胚状体。所以必须控制胚状体同步发育。1、胚状体发生方式（1）可来源于外植体的表皮细胞（2）来源于愈伤组织细胞（3）悬浮培养中由单细胞来源的胚状体（4）由花药花粉培养产生的单倍体胚状体（5）来源于原生质体的胚状体2、控制胚性细胞同步分裂的方法（l）抑制剂法——用DNA抑制剂处理细胞培养物细胞培养初期加入DNA合成抑制剂如五氨基尿嘧啶，使细胞DNA合成暂时停止。一旦除去DNA抑制剂，细胞开始进人同步分裂。如单冠毛菊细胞悬浮培养中，采用四种DNA合成抑制剂，经过12－24h处理，在除去抑制剂后10－16h，细胞出现有丝分裂高峰。（2）低温法——低温处理调控胚状体的同步生长低温处理抑制细胞分裂，经过一段时间后再把温度提高到正常培养温度，也能使胚性细胞达到同步分裂的目的。（3）渗透压法——利用渗透压调控胚状体的同步生长调节渗透压控制胚性细胞的同步发育。不同发育阶段的胚，具有不同的渗透压要求。如向日葵胚发育不同阶段对糖浓度要求不同，球胚期17．5％，心形期胚12．5％，鱼雷胚期8．5％，成熟胚期0．5％。可以用调节渗透压的方法，来控制胚的发育，使其停留在某一阶段，然后同步发育。（4）分离过筛法用不同孔径的尼龙网过滤，来选择不同发育阶段的胚。或者采用密度梯度离心法来选择不同发育阶段的胚。然后再转入适宜它们发育的培养基上，使幼胚继续发育，例如胡萝卜，1L培养基可产生20万个体细胞胚，有可能采用这种方法。（5）通气法——利用气体调控胚状体的同步发生通气调节细胞分裂，乙烯的产生与细胞分裂有着密切关系。在细胞分裂达到高峰前，有一个乙烯合成高峰。在培养基中通入乙烯或氮气，每10h或20h通三次，每次通3－4S，可将细胞的有丝分裂提高到12％－16％。三、人工种皮的研制1、对人工种皮的要求①人工种皮材料（包埋剂）对胚状体无损害，成本低廉。②人工种皮要有一定硬度，能够保护胚状体在生产、贮存和运输和播种过程中不受损害。③种皮中应含有所需的营养要素、生长激素和防腐剂，有利于胚状体的萌发。2、人工种子包裹材料的选择胚状体的包埋，首先应选择较好的包埋剂。目前有5中较好的胶体，为：海藻酸盐、琼脂、角叉菜胶、白明胶、槐豆胶。其中最好的是海藻酸钙，具凝聚好、使用方便、无毒、价格便宜等特点。四、人工胚乳的研制人工种子中，另一个重要成分是人工胚乳。胚乳是胚胎发育的营养条件。有胚乳植物（芹菜）其人工种子中必须具有人工胚乳；无胚乳植物（苜蓿）从理论上讲它不需要胚乳。但是它的人工种子在土壤条件下，成株率很低。故无胚乳植物的人工种子也应该研制人工胚乳。1、人工胚乳的成分（1）无机盐混合物（2）碳水化合物淀粉和糖（3）蛋白质2、人工胚乳研制的两条途径（1）直接法：凝胶囊中直接加入大量元素和碳水化合物及防病用抗生素。以保证种胚的基本营养和碳源。（2）微型包裹法：首先将碳水化合物和大量元素包裹在微型胶囊内，然后再把微型胶囊和种胚一起包裹在褐藻酸钙（人工种皮）中。目的是使人工胚乳在人工种子内有控制地释放。五、人工种子包埋方法1、干燥包理法将胚状体置于23℃，相对湿度为70％土5％，黑暗条件下逐渐干燥。然后用聚氧乙烯包裹后贮藏。发现经过包理的胚状体，重新水合后仍能发芽并生长。2、液胶包理法将胚状体悬浮在一种黏滞的流体胶中，直接插入土壤。Baker（1985）将胡萝卜体细胞与蔗糖、激素和流体胶混合，播于温室中。有4％的胚仅活了7d，后因干燥而死亡。3、水凝胶法用褐藻酸钙水溶性胶囊包埋胚状体，用以生产人工单胚种子称水凝胶法（1986）。海藻酸钠作包埋介质的操作程序是：在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀然后将其逐滴滴入2.0%～2.5%的CaCl2溶液中，经20～30min的离子交换作用，即能形成含有繁殖体并具有一定刚性的小球珠（bead）再用水漂洗20min以终止反应。此时的人工种子是一种胶囊状结构，将其晾干后可贮存或播种。人工种子的制作流程选取目标植物从合适的外植体诱导愈伤组织把愈伤组织转移到液体培养基愈伤组织在液体培养基中增生扩大愈伤组织转移至无激素培养基获得目标植物体细胞胚包裹人工种皮温室（大棚）播种六、人工种子的应用前景人工种子从根本上说是植物离体快繁技术的延伸和发展。与常规离体繁殖技术相比，除了有离体繁殖所具备的优势外，在应用上还有更多潜在的优点。如可贮藏、因而可周年生产；可直接播种，减少了试管苗移栽在操作和管理上的困难，可机械化操作和常规的田间管理；可长距离运输，因此可建立相对集中的大型生产企业，实现资源和技术优化。人工种子利用中的问题：1、贮藏问题人工种子含水量大，常温下易萌发，也易失水干燥。2、体细胞无性系变异，人工种子植株中最多观察到的是子叶数目的变化，而子叶数目对幼苗生长是有一定影响的。3、成本问题目前限制人工种子的商业利用的最大问题是成本，如每粒苜宿人工种子的成本为0.264美分，而天然种子的成本仅0.0066分，相差40倍。4、繁殖体生产技术和人工种皮材料的研制但随着研究的深入，限制其在商业应用中的问题将逐步得到解决，实现其诱人的应用前景，必将对作物遗传育种、良种繁育和栽培等起到巨大的推进作用。第二节种质资源离体超低温保存一、种质保存的发展概况二、超低温冷冻保存种质的方法及原理三、超低温冷冻保存种质的程序四、超低温冷冻保存种质技术的应用前景一、种质保存的发展概况

植物种质资源——又称植物遗传资源，是指一定地域上对人类有用的所有植物的总和，是人类生存和发展必不可少的物质基础。种质——是亲代传递给子代的遗传物质，这种传递可通过生殖细胞，也可通过体细胞。植物种质资源保存主要通过原生境保存和非原生境保存。原生境保存是将植物的遗传材料保存在它们的自然生境中。原生境保存的方法：植物保护区(保存整个群落)农田种植

非原生境保存将植物的遗传材料保存在不是它们的自然生境中。保存方法：种质保存贮藏保存离体保存基因文库保存种质保存——为了保存种质资源的种子或无性繁殖器官的生活能力，并不断补充其数量，种质资源材料必须每隔一定时间（如1-5年）播种一次，这种保存方式为种质保存。贮藏保存——是利用控制贮藏时的温度和湿度条件，保持种质资源种子或贮藏器官生活力的方法。低温、干燥、缺氧可抑制种子呼吸，是延长种子寿命的有效措施。当种子含水率在4%-14%时，含水率每下降1%，种子寿命可延长一倍；贮藏温度在0-30℃时，温度每降低5℃

，种子寿命可延长一倍。

离体保存——是将植物外植体在无菌的环境中利用组织培养技术进行植物种质资源保存的方法。它是利用细胞工程技术对植物种质资源进行保存的一种新方法，利用这种方法可以解决用常规种子贮藏所不易保存的某些材料。离体保存的植物材料种类多样，有：试管苗、愈伤组织、悬浮细胞、幼芽生长点、花粉、花药、体细胞、原生质体、幼胚、组织块等。根据离体保存的环境条件或使用的化学试剂，离体保存方法为：低温保存超低温保存或冰冻保存生长抑制剂保存基因文库保存——是利用人工方法，从植物中获取DNA，后用限制性内切酶将DNA切成多片断并与载体连接，再导入大肠杆菌或酵母中繁殖，使得生物体内所有基因都得到保存。当需要某个基因时，通过一定方法进行提取。这种保存方法既可以长期保存该物种的遗传资源，还可以通过反复培养繁殖、筛选、获得各种基因。二、种质资源的离体保存优越性：所占空间小、保存数量大、成本低、不受病虫害侵袭。理想的保存条件是使培养物处于无生长或缓慢生长状态，需要时能迅速恢复正常生长。离体保存方法：低温保存超低温保存生长抑制剂保存1、低温保存是一种缓慢生长保存方法，是通过控制培养温度来限制培养物各种生长因子的作用，使培养物生长减小到最低限度。植物生长有一个相应的最适温度，当植物种质资源离体材料在非结冰的低温下培养时，由于酶的作用受到抑制，培养物生长受到极大限制而生长缓慢，继代间隔时间延长，达到较长期保存的目的。2、超低温保存是在液氮（-196）中保存的活细胞物质代谢和生长几乎完全停止的保存方法。（1）方法将离体培养的茎尖分生组织、愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体经冷冻防护剂处理，然后送入一196℃液氮超低温库内，进行“超低温冷冻”保存。

常用的冷冻防护剂种类有甘油、甘露醇、脯氨酸、二甲基亚枫（DMSO）。冷冻防护剂的使用浓度为5％－10％。（2）超低温冷冻保存原理

在冷冻过程中避免细胞水分结冰,并且在解冻过程中防止细胞内水分的次生结冰而达到植物材料保存的目的.

冷冻防护剂作用：l）常用的冷冻防护剂，属于低分子量的中性物质。在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，水的固化程度减弱。因而对于降低培养基冰点和植物组织、细胞的冰点起重要作用。2）冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。3）二甲基亚枫除上述作用外，极易渗入细胞内部，可防止细胞在冷冻和融冰时，引起过度脱水而遭受破坏，二甲基亚枫起到保护细胞的作用。由于冷冻防护剂，特别是二甲基亚枫的作用，才有可能使植物的茎尖，愈伤组织、单细胞和原生质体经受住液氮一196℃的超低温冷冻。预培养冷冻处理超低温保存解冻再培养（3）超低温冷冻保存种质的程序

1）预培养为保证茎尖在液氮处理后具有稳定且高的存活率，需进行一定的预处理，或在冷冻防护剂下进行预培养，或直接进行低温（-3-10℃）预处理。目的是提高细胞抗寒力，培养时间3－4周。方法：（l）加速传代以提高分裂细胞的比例。细胞分裂时体积减小，细胞内自由水含量下降，使细胞的抗寒力相对提高。（2）用甘露醇、糖等提高培养基渗透压，以提高培养组织和细胞的渗透压来提高抗寒力。（3）加入脯氨酸或二甲基亚枫进行短期预冷处理，防止细胞和组织结冰。冷处理时间为20－60min。然后使温度逐渐下降接近0℃实行低温锻炼2）冷冻处理（l）保存材料的温度必须降至0℃。（2）加入冷冻防护剂（甘油、甘露醇、脯氨酸、糖类、二甲基亚枫等。各种冷冻防护剂，使用时需根据不同植物材料进行组合和浓度的选择），然后进入冷库降温冷冻。使用浓度为5％－10％。用量与培养物等体积混合。

降温冷冻有预冻、慢速冷冻、快速冷冻和干燥冷冻法（l）预冻法：加入冷冻防护剂后，使温度下降一70-—20℃范围内进行预冷，然后再进入一196℃液氮库超低温冷冻保存。（2）慢速冷冻法：在加入冷冻防护剂后，逐渐降低温度，以每分钟下降l－5℃的速度降低温度。待温度降到一40℃或一100℃时，平衡lh，即稳定lh。然后进入一196℃液氮低温库，超低温冷冻保存。（3）快速冷冻法在0℃下加人冷冻防护剂二甲基亚枫后，直接进入一196℃液氮库。（4）干燥冷冻法是将材料置于27-29℃烘箱内降低植物含水量，再投入液氮中保存的方法。此法可防止材料冻死。具体方法：①预培养：3－4周；②加入冷冻防护剂在0℃下放置20－60min；③以每分钟2℃速度下降至一100℃稳定lh；④进人一196℃液氮库；保存3个月的花粉胚，保持30％的存活率。3）超低温保存贮存在液氮容器中，并不断补充液氮，维持冷冻温度。4）解冻

1）快速解冻法：采用迅速解冻法，直接投入37℃一40℃下迅速解冻，以避免组织和细胞脱水死亡。2）慢速解冻法：将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻，再逐级升至室温下进行解冻的方法。解冻方法的选择与冷冻方法有一定关系：一般冷冻降温速度超过-15℃/min解冻时宜采用快速方法，否则应采用慢速解冻法。5）再培养是指将已解冻的材料重新置于培养基上使其恢复生长的过程。再培养是检验冷冻保存效果或确定保存方法是否合适的最根本方法。根据植物种类，提供和满足原来的培养条件进行培养，使细胞恢复分裂能力。诱导器官分化和植株再生，当然对于次生物质生产来讲，这一步是恢复高产细胞株的生化合成能力。3、生长抑制剂保存1）高渗保存法利用培养基的高渗透压来抑制离体培养材料生长的种质保存法。如加入甘露醇、蔗糖、PEG等。2）生长抑制剂保存法在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料生长，达到长期保存种质材料的保存方法。常用的生长调节剂有：ABA、青鲜素、矮壮素、多效唑等。3）抑制生长的其他保存法饥饿法矿物油覆盖法低光照培养低压保存四、超低温冷冻保存种质技术

的应用前景超低温冷冻保存种质技术，研究成功的植物种类有数10种，但由于所用材料的类型不同，对低温冷冻的反应也不同。

1、悬浮细胞和愈伤组织的保存2、生长点冷冻保存3、胚状体（体细胞胚、花粉胚）的冷冻保存4、原生质体冷冻保存1、悬浮细胞和愈伤组织的保存悬浮细胞冷冻保存中，发现旺盛分裂的对数生长期的细胞，对冷冻的耐受力强，而静止期和延迟期的细胞对冷冻最为敏感。冷冻处理前，加速传代和在培养基中加入冷冻防护剂（甘露醇、脯氨酸），可提高细胞抗寒力。结构紧密的细胞团（愈伤组织）比单个细胞和松散的细胞团耐受冷冻。解冻后，容易恢复细胞分裂。2、生长点冷冻保存取顶端分生组织（茎尖）直径为0.1mm，长度为0.3-0.5mm（带一对叶原基），冷冻前在5%二甲基亚枫中预培养数天，然后采用慢速冷冻法，以每分钟下降1℃，降温至-40℃再进入液氮库。3、胚状体（体细胞胚、花粉胚）的冷冻保存如烟草、颠茄、四季樱、矮牵牛的体细胞或花粉胚预培3－4周，加人5％－10％二甲基亚枫，在0℃下放置20－60min。采用慢速冷冻法，以每分钟2℃速度降温至一100℃。稳定后，进入一196℃下冷冻保存效果好，球形期花粉胚解冻后有30％存活率，而心形胚、子叶胚仅少量存活。发现球形胚比心形胚、子叶胚抗寒力强，原因是球形胚渗透压高，抗寒。4、原生质体冷冻保存由于操作难度大，成功例很少，仅胡萝卜、地钱原生质体超低温冷冻保存成功。超低温冷冻保存研究历史不长，取得的成绩不小，发展形势“方兴未艾”。

第十一章植物细胞遗传转化体系的建立分子生物学的发展已经证明，所有生物，包括微生物、植物、动物和人类在分子结构上都是相同的，即由DNA和蛋白质组成。同时也进一步证明，生命的基本形态还是细胞；再大、再复杂的DNA或蛋白质都不具有生命的基本特征。转化——植物细胞对外源遗传物质的摄取、整合及表达的过程。通过遗传转化，把控制特定形状的基因转入植物基因组，可以打破原有的种属间生殖障碍，缩短育种周期，创造出常规育种方法很难得到的新型优良品种，是定向改良植物性状的有效手段。植物基因工程中，我们把接受外源（目的）基因的生命体系称为“受体”。尽管接受外源基因的受体包括叶圆片（盘）、胚性愈伤、胚状体、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等不同的形态，但其基本形态还是细胞。其中叶圆片与农杆菌共培养是最简单的转化方法；愈伤组织的转化效率高、生长速度快，是快速检测外源基因表达的最好受体；原生质体则是单克隆转化的最佳材料。第一节植物基因转化的受体一、原生质体二、悬浮细胞三、胚性愈伤组织四、胚状体五、叶圆片六、其他受体一、原生质体原生质体是无细胞壁的细胞。与悬浮细胞一样，被转化的受体细胞是单个独立的细胞，为选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。二、悬浮细胞以悬浮细胞作受体的转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法、PEG介导法、电激法和显微注射法等。三、胚性愈伤组织愈伤组织的转化方法也适用于胚性愈伤组织。

四、胚状体胚状体是由愈伤组织经过改造后分化而来的，其转化方法也同愈伤组织。五、叶圆片叶圆片（叶盘）是农杆菌转化的主要受体。六、其他受体除了叶圆片、愈伤组织、悬浮细胞或原生质体等几种常见的受体之外，还有多种不同类型的组织或器官可作为外源基因的受体，如子叶、胚轴、茎段、根、体细胞胚、花粉等等。第二节、植物基因转化的方法

一、根癌农杆菌介导法二、基因枪转化法三、聚乙二醇-介导法四、其他转化方法1、电激法2、显微注射法3、花粉管通道法4、脂质体转化5、激光微束转化法一、根癌农杆菌介导法根癌农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。二、基因枪转化法基因枪法又称微弹射击法，是由KLein（1987）等建立的。他们利用超声波使外源DNA液均匀地包裹钨弹（0．2－2.0微米），利用手枪的动力原理发射出微弹与DNA的复合体，击中靶细胞，穿透细胞壁和原生质体膜，为进一步整合到基因组提供机会，实现外源基因在完整组织中的表达。根据基因枪的动力原理，目前至少有6种不同类型的基因枪：火药基因枪、高压放电基因枪、压缩气体基因枪、粒子流基因枪、微靶点射基因枪和气枪基因枪。基因枪法已成为继农杆菌介导法之后的第二大基因转化方法，尤其在禾本科作物上应用更为广泛。三、聚乙二醇-介导法聚乙二醇（PEG）介导法与PEG诱导原生质体融合的机理相似，不同的是后者发生在原生质体之间，而前者发生在原生质体与DNA之间。在高浓度的二价钙离子和高pH值的条件下，略带负电的高分子PEG可能促进DNA向原生质体膜沉淀，或参与原生质体的内吞作用下，使外源DNA分子进入原生质体和细胞核，并整合到染色体上。

PEG法是进行基因直接转移的普遍方法，成本低廉，效果稳定。四、其他转化方法1、电激法电激法是采用高压直流电脉冲的“电激穿孔”作用打开原生质膜，促进细胞膜吸附的DNA进入植物原生质体。电激法转化能有效地将外源DNA导人植物细胞，而且不影响原生质体再生植株的过程。2、显微注射法这是利用特制的显微注射仪直接将外源遗传物质注入植物细胞的转化方法。该方法虽然每次只能注射少量的受体细胞，但其转化的成功率高，而且可以省去选择性标记的麻烦。3、花粉管通道法周光宇等（1983）首创的花粉管通道法，是将外源DNA的片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞。这种方法开创了整株活体转化的先例，在改良农作物的遗传特性上有很大的潜力。花粉管通道法的特点是直接操作于整体植株，参与了被转化植物的生殖过程，避开了从细胞到组织的培养，并能与常规育种技术相结合且操作简单，经济适用。4、脂质体转化脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂双分子层围成的囊状结构，一直被作为生物膜模型从结构和功能上进行研究。由于脂质体内能够包装许多大分子如病毒、核酸和染色体，并能转入植物细胞。所以，开展了以脂质体作为植物细胞遗传工程载体的广泛研究。脂质体作载体在植物细胞工程中已有广泛的研究。用脂质体包装带有抗药性标志的、编码氨基糖苷磷酸转移酶嵌合基因的质粒DNA，用PEG诱导该脂质体与烟草原生质体融合，获得的转基因再生植株具有抗性和转化基因的酶活性，种子能在含有药物的培养基上正常地萌发、生长，转化基因能随种子传递到后代，并遵循孟德尔遗传规律。脂质体作为载体，能保护细胞内部的遗传物质；与植物细胞相互作用时毒性很小；受体范围广，对原核和真核细胞均适用；制备脂质体比其他质粒载体容易，价格低廉。5、激光微束转化法激光微束穿刺技术是利用激光微束在受体植物细胞上穿孔，通过细胞内外的渗透压差将外源基因直接导人带壁的植物细胞内。第三节转基因植株再生及其检测

一、转基因植株再生植株再生是基因转移的关键步骤，直接决定能否获得转基因植株。转基因植株的再生一般分为两种形式：一种是愈伤组织再生，转化后的外植体首先发生愈伤组织，然后在分化培养基上诱导出芽直至长成一个完整的植株，这是植株再生中最常用的一种方式。另一种是直接再生，从外植体直接诱导出芽而不经过愈伤组织的分化。二、转基因植株的检测当带有目的基因的嵌合基因被转入某种受体系统（细胞或组织）后，必须对转基因植物材料进行分析与鉴定，以确定外源基因是否在转基因植物中正常表达。在建立植物遗传转化体系时，常采用报告基因作为标记，以便快速检测。对转基因植株中目的基因的表达主要采用分子生物学方法检测，包括Southern杂交、Northern杂交、Western杂交和聚合酶链式反应（PCR）等方法。1、报告基因报告基因是明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，又称选择标记基因。不同的报告基因需要采取不同的检测方法。2、Southern杂交这是Southernl975年发明的方法，其原理是利用两条单链DNA的碱基互补性，来检测外源DNA的转化结果。此方法是验证转化基因是否存在于被检测植株的最常规的手段，但不能得到基因是否表达的信息。外源基因往往