微生物实验指导全文

实验一显微镜的使用微生物的个体很小，必须用放大倍数高的、结构精密的显微镜，才能了解其个体的形态特征及特殊的繁殖方式。因此，显微镜是学习微生物的重要工具，只有正确并熟练地掌握显微镜的使用方法，才能研究和观察微生物的形态。本实验通过观察细菌的染色涂片标本，重点练习和掌握油镜的使用方法。一、器材准备1、具油镜头的显微镜。2、细菌染色涂片标本假设干片。3、香柏油、二甲苯和擦镜纸。二、显微镜的构造1、机械局部显微镜的机械局部包括镜座、镜身、镜筒、载物台、物镜转换器、推进器、粗和细调螺旋等。2、光学局部：光学局部包括目镜、物镜、聚光镜、虹彩光圈、反光镜等。三、显微镜的性能显微镜的总放大倍数等于物镜放大率和目镜放大率的乘积。但显微镜性能优劣，不只是视其放大倍数的上下，而更主要是视其辨晰细微结构的能力，即性能良好的显微镜必须使观察的物体放大倍数高，而且清晰。显微镜辩析细微结构的能力可用分辨率表示。其能够辨晰的细微结构愈小，那么分辨率愈高，分辨率的上下，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。假设设物镜分辨出的物体两点间的最短距离为D，那么D=D——物镜分辨出物体两点间的最短距离。——光波长度。n——介质折射率。——镜口角半数之正弦。由上式可见，D值愈小，物镜的分辨率愈高，愈能分辨出物体的细微细构，物象愈清楚。根据上式看出，可通过减低波长、增大介质折射率和加大镜口角三方面来提高分辨率。对于普通光学显微镜，采用增大介质折射率来提高数值口径，是提高分辨率的可行途径。四、显微镜的使用：显微镜应直立实验台上，不要倾斜，因微生物学镜检过程中，常用水浸片和油浸片，如显微镜台倾斜，将导致水或香柏油流动，影响观察。应将显微镜放正，把低倍物镜旋到镜筒下方，转动粗螺旋，使镜头与载物台距离约，上升聚光器，使与载物台外表相距约1.0mm将细菌染色涂片标本置于载物台上，涂片部位放在正中，下降低倍物镜至标本约处，观察目镜并调转细螺旋，以获得清晰的物像，再移动推进器，将所观察的部位置于视野中心。将低倍镜转成高倍物镜，再做进一步调整。经过低倍和高倍物镜的初步观察就能转换成油镜正式观察。油镜放大倍数很高，其工作距离很短，一般只有，应特别小心，以免损坏镜头和标本。在使用油镜时，标本上要滴一滴香柏油，再将镜头徐徐下降浸入香柏油中，直到几乎与标本相接触为止。左眼看着目镜，向上转调粗螺旋，观察到模糊标本物像后，改用细螺旋，至标本物象清晰为止。a、枯燥系物镜b、油浸系物镜图1枯燥系物镜与油浸系物镜光线通路在使用油镜时加香柏油，是因香柏油的折光率是1.515，接近于玻璃1.52，大于空气的1.0；由于介质的折光率相近，光线折射少，进入油镜的光线增多，物镜的分辨率提高。这样，就能看清检视物了。见图1五、显微镜的保养：油镜使用完后，必须用擦镜纸去擦镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少量二甲苯揩擦镜头，随后用一片擦镜纸将剩余二甲苯擦净，否那么粘固透镜的胶质会被二甲苯溶液溶解，日久镜片易移位脱落。物镜成“八〞字形，紧靠载物台；聚光器放在最低处，反光镜直立，用纱布擦干净各部位并把纱布盖上，放回木箱中。六、细菌形态的观察按油镜的使用方法，每个同学自己动手找出一片染色涂片标本并绘图，其余的涂片，可互相观察或从示范片绘出。七、答复以下问题1．使用油镜时，为什么要加香柏油？能否用水或其它油代替？〔附：一些物质的折光率〕2．油镜使用完毕后应注意哪些问题？

实验二微生物染色〔一〕一、目的：学习微生物的涂片染色的操作技术，掌握微生物的简单染色，革兰氏染色的根本原理和方法。二、原理：染色是细菌学中一个重要而且很根本的技术，由于微生物与各种不同性质的染料具有一定的亲合力，从而使微生物着色，着色后的菌体折光性弱，色差明显。在显微镜下容易观察细胞的内部结构及其内含物，因此，微生物染色是进行微生物形态观察的重要方法之一。染色分为单染〔简单染色〕，复染〔革兰氏染色，抗酸染色〕，单染较简单，以同一种染料使菌体着色，以显示微生物的形态；复染中的革兰氏染色是一种重要的鉴别染色，利用两种不同性质的染料，即草酸铵结晶紫和沙黄染液先后染色菌体，当用酒精脱色后，如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物的颜色，即呈紫色的细菌叫革兰氏阳性菌；如果草酸铵结晶紫与碘的复合物被酒精脱掉，菌体染上沙黄的颜色，呈红色叫做革兰氏阴性菌。三、材料与用具：〔一〕大肠杆菌〔Escnerichiacoli〕金黄色葡萄球菌〔Staphylococcusaureus〕枯草芽孢杆菌〔BacillusSubtilis〕普通变形杆菌〔ProteusVulgaris〕〔二〕染色：1．简单染液：齐氏石碳酸复红染液，吕氏美兰染液2．革兰氏染液。〔1〕草酸铵结晶紫染液〔染液〕、〔2〕路哥氏碘液〔媒染剂〕〔3〕95%乙醇溶液〔脱色剂〕〔4〕沙黄〔蕃红〕酒精溶液〔复染剂〕〔三〕用具显微镜、酒精灯、接种环、无菌水、香柏油、二甲苯、牙签、载玻片、纱布、滤纸、镜头纸、镊子、染色缸、火架、玻片架、烧杯等。四、方法。〔一〕制片1．涂片：取保存在酒精溶液中的干净玻片，在酒精灯上烧去残酒精、待凉，用特种铅笔在玻片的右侧，注明菌名，色染类型，在玻片中央滴加一小滴无菌水，以无菌操作取少许菌苔，在玻片的水滴中涂布均匀，成一薄层。2．风干：在空气中自然枯燥，切勿在火焰上烘烤。3．固定：将已枯燥的涂片向上，在微火上迅速通过2—3次杀死细菌，凝固菌体蛋白，使得菌体与玻片结合牢固。〔二〕染色1．简单染色：在已制好的涂片菌膜处，滴加吕氏美兰染液染色3—5分钟。或滴加齐氏碳酸复红染液染色１—2分钟，以流水冲洗涂片，至水无色为止，后用滤纸吸干涂片的水滴，干后，待镜检。2．革兰氏染色：〔1〕在已制好的涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗。〔2〕滴加路哥氏碘液媒染1分钟、水洗，用滤纸吸干残存水滴。〔3〕斜置玻片于烧杯上端，滴加95%酒精脱色，并轻轻摇动载玻片，直洗至流出酒精刚刚不出现紫色时即停止，〔约半分钟至1分钟〕，脱色完毕后，水洗，滤纸吸干。〔4〕滴加沙黄染液复染1分钟，水洗，滤纸吸干后，备镜检。3．螺旋体染色：〔1〕取清洁载玻片一张，在玻片中央滴加无菌水一滴。〔2〕用无菌牙签取牙垢少许，涂于玻片水滴中，摊匀，风干，在火焰上通过二至三次以兹固定。〔3〕滴石碳酸复红染液，染色三分钟，水洗，用滤纸吸干后，备镜检。五、内容：〔一〕用金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌制简单染色片，在油浸物镜下观察。〔二〕用金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，普通变形杆菌，枯草芽孢杆菌制革兰氏染色片，在油浸物镜下观察，区别革兰氏阳性菌和阴性菌。〔三〕用牙垢制螺旋体染色片，在油浸物镜下观察，注意螺旋体的形态。六、报告：〔一〕试述革兰氏染色的程序及染色原理。〔二〕将本实验观察结果记录于表中。

染色方法菌名染色结果简单染色吕氏美兰染液齐氏石碳酸复红革兰氏染色七、思考题：〔一〕为什么细菌染色时所用的染料多属于碱性染料？为什么涂片需要固定？为什么制片枯燥后才能用油镜观察？〔二〕革兰氏染色过程中，哪些步骤是关键，为什么？附：革兰氏染色谱染色反响微生物革兰氏阳性〔Ｇ＋〕革兰氏阴性〔Ｇ－〕球菌葡萄球菌链球菌肺炎球菌四联球菌脑膜炎球菌淋病双球菌卡他球菌杆菌白喉杆菌耐酸性杆菌芽孢杆菌梭状芽孢杆菌大肠杆菌沙黄氏杆菌痢疾杆菌变形杆菌绿脓杆菌嗜血性杆菌布鲁氏杆菌巴氏杆菌属马鼻疽杆菌克勒伯氏菌属其他放线菌真菌弧菌螺旋体菌

实验三微生物染色〔二〕一、目的：了解微生物学中最常用的几种特殊染色及其在研究微生物形态分类中的重要性掌握芽孢，荚膜，鞭毛染色方法。二、原理：芽孢、荚膜、和鞭毛染色，都是利用细菌细胞不同的构造局部对染料的亲和力不同，用各种特殊染色法，使之显示出不同的颜色，籍以显微观察。三、材料与用具材料：枯草芽孢杆菌〔BaoillusSubtilis〕园褐固氮菌(AzotobacterChroococcum)普通变形杆菌(ProteusVulgaris)荧光假单胞菌(Pseudomonasfluoroscons)醋酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumacetobutylicum)苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)北京棒状杆菌AS1.299(CorynobacteriumPekinense)染液：芽孢染液5%孔雀石绿水溶液，0.5%沙黄〔蕃红〕水溶液荚膜染液：石碳酸复红染液5%黑色水溶液〔或用墨汁〕鞭毛染液丹宁酸〔鞣酸〕A液FeCl315%甲醛1%NaoHB液 2%硝酸银溶液用具：显微镜，载玻片，玻片架，滤纸接种环，无菌水，酒精灯，香柏油，二甲苯，火柴，擦镜纸等。四、方法芽孢染色法芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料亲合力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚，透性低，着色、脱色均较困难，因此领先用一弱碱性染料孔雀石绿在加热条件进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料那么难以透出，假设再用复染液〔沙黄〕进行复染色，此时菌体即被染成红色，而芽孢难着色，仍呈绿色。染色步骤：制片〔方法同前〕。在玻片涂有菌苔处，滴加孔雀绿染液，使之充满玻片。将玻片置于酒精灯高出火焰，徐徐加热，使染液在产生蒸气的情况下保持2分钟，随时滴加染料，切勿使染液煮沸或干涸。待玻片冷却后，水洗〔要求同前〕，吸干残水。0.5％沙黄染液复染1分钟，水洗、吸干，备镜检。菌体红色，芽孢绿色。荚膜染色荚膜是包围在细菌细胞外面一层粘液性物质，其主要成份是多糖类，不易被染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景染色而把不着色透明的荚膜衬托出来，荚膜很薄，易变形，因此制片时一般不用加热固定。染色方法：有三种方法，可选作一种。方法1：取少许菌苔与一滴石碳酸复红染色，在玻片上混合，染色约1分钟，然后加一滴黑色素水溶液或稀墨汁一滴，用另一块玻片，将菌、染料、墨汁推成一薄层，自然风干，备镜检，菌体红色，荚膜黑色。方法2：取少许菌苔与一滴无菌水，在玻片上混合，摊平，待自然风干后，用石碳酸复红染2－3分钟，水洗〔注意水不要直接冲洗涂菌处〕，用滤纸吸干，在玻片一端加墨汁一滴，然后用另一块玻片，将墨汁推成一薄层，自然风干。备镜检，菌体红色，荚膜无色，背景黑色。方法3：取少许菌苔与一滴无菌水，在玻片上混合，摊平，待自然风干后，用草酸铵结晶紫染色30秒钟左右，水洗〔注意水不要直接冲洗涂菌处〕用滤纸吸干，备镜检，菌体紫色，荚膜无色。鞭毛染色法细菌的鞭毛极为纤细，直径在微米(m)以下，因此在普通光学显微镜下不能见到，只有用特殊的染色方法才能把鞭毛显示出来，鞭毛的染色方法很多，但主要的原理都是采用不稳定的胶体溶液作媒染剂，在鞭毛上生成沉淀，加大鞭毛的直径，然后再进行染色。同时，培养稍久的菌，鞭毛易脱落，所以要用新鲜的菌体，一般是用经3－5代〔每代培养时间16－20小时〕最后一代接到含—1.2%琼脂的软洋菜培养基(带有冷凝水)经12－16小时培养的菌体为佳。染色步骤Ⅰ、制片：从酒精溶液保存的玻片缸中用镊子取出一张玻片，在火焰上烧去残存的酒精视玻片无水迹，光滑即可用，注明菌名。从已移接3—5代带有冷凝水的斜面菌种的冷凝水处，以无菌操作，用接种环取一环菌液。3．将底玻片倾斜，在带有菌液的菌环上滴下一滴无菌水让水从玻片上端自然流向下端，切勿用接种环涂抹，以免损伤鞭毛。4．自然风干。II、染色方法1．Ａ染液3—5分钟，用蒸馏水冲洗净Ａ液，〔注意：一定要充分洗净Ａ液后再加Ｂ液，否那么背景很脏〕。再用Ｂ液冲洗残水，使Ｂ液充满玻片，在火焰上轻轻加热至冒气后，维持30—60秒，然后用蒸馏水冲洗，滤纸吸干，备镜检，菌体为黑褐色，鞭毛为深褐色。2．鞭毛染色也可采用不加热的方法，但染色时间要长些，一般Ａ液染6—7分钟，Ｂ液染5分钟，镜检菌体及鞭毛都呈褐色。五、内容：〔一〕用枯草芽孢杆菌进行芽孢染色，置油浸物镜下观察。〔二〕用园褐固氮菌进行荚膜染色，置油浸物镜下观察。〔三〕用普通变形杆菌和萤光假单胞菌进行鞭毛染色，置油浸物镜下观察，注意鞭毛的着生位置。选作内容：〔一〕制醋酪酸梭状芽孢杆菌的芽孢染色片，置油浸物镜下观察，注意芽孢的位置。〔二〕制枯草芽孢杆菌的细胞壁染色片，油浸物镜观察细胞壁呈深紫色，细胞质呈淡紫色，〔常规制片，5％鞣酸染5分钟，水洗，％结晶紫染3—5分钟〕。〔三〕北京棒状杆菌Ａ异染粒的染色片，油镜观察，菌体呈淡兰色，异染粒呈深兰色．〔常规制片，甲液染5分钟，倾去甲液，用乙液冲去甲液，并染1分钟，水洗〕。甲液：甲苯胺兰〔Toluidineblue〕克孔雀石绿〔Malacnitegreen〕克冰醋酸１毫升酒精〔95%〕2毫升蒸馏水100毫升乙液：碘〔I〕2克碘化钾〔KI〕3克蒸馏水300毫升〔四〕苏云金杆菌的伴孢晶体染色片，油镜观察晶体呈红色菱形状，游离的芽孢为红色圈状。〔染色液为1／10的石碳酸复红染液〕〔五〕巨大芽孢杆菌的聚Ｂ－羟基丁酸〔Poly-β-hydroxybutyrioacid〕染色片，油镜观察，菌体红色，聚β－羟基丁酸为兰黑色〔常规制片，苏丹黑染10分钟，水洗，吸干残水，二甲苯洗脱色素，０.5％蕃红复染1—2分钟〕０.3％的苏丹黑染液。苏丹黑B(SudanblaekB)乙醇(70%)100毫升混合后，用力振荡,过夜备用。六、报告：〔一〕绘图表示芽孢，荚膜和鞭毛。〔二〕将本次实验观察结果记录在下表：类菌别名芽孢染色荚膜染色鞭毛染色菌体颜色芽孢颜色菌体颜色荚膜颜色背景菌体颜色鞭毛颜色鞭毛位置及数目七、思考题：1．芽孢、荚膜、鞭毛染色为什么称为特殊染色？2．鞭毛染色与其他染色有何不同？为什么？附：鞭毛染色所用载玻片的清洗：选择光滑无伤痕的玻片，先用洗衣粉煮沸，洗衣粉最好在洗玻片前加蒸馏水煮沸，用滤纸过滤去渣，为了防止玻片彼此磨损，最好把载玻片放在特制的架上煮，煮后稍冷却后取出，用清水洗净，再放入浓洗液中浸泡24小时左右，取出用清水冲洗残酸，最后用蒸馏水洗净，沥干水并放入95%乙醇中脱水，取出玻片，用火烧去酒精，立即使用，在洗净的玻片上滴上水滴后应能均匀散开。

实验四真菌的形态一、目的：掌握真菌的形态和结构：学习小室培养的方法：检测环境中微生物的数量和种类二、原理：带有培养基的小空间可以造成真菌适宜的生长环境。这样培养的微生物可以保持菌体完整的形态和结构。便于观察和研究在自然界和人体存在的各种微生物。用适宜的培养基可以检测出它们的存在。三、村料和用具〔一〕材料：毛霉〔Mucormucedo〕黑根霉〔Rhizopusnegricans〕黑曲霉(AspergillusSP)产黄青霉〔PenicilliumChrysogenum〕细黄链霉〔Streptomycesmicroflarum〕啤酒酵母〔Saccnaromycescereviiae〕〔二〕用具：培养皿“U〞形玻璃棒四、方法〔一〕小室培养：在进行放线菌和各种霉菌的形态观察时，可以采用压滴法制片〔见实验一〕但制片时，菌体的各局部结构往往被破坏。不宜观察到完整典型的形态。采用小室培养可以清晰地观察到菌体的完整结构，方法如下：1．准备好清洁无菌的器皿：包括培养皿“U〞形玻璃棒载玻片、盖玻片、滤纸。2．预先在一套无菌培养皿内倒入已灭菌的固体培养基〔培养基组分视所培养的微生物而定。但浓度比原配方稀三分之一。〕成一厚约3—4mm的薄层。待冷凝后，用无菌小刀切成10×10mm3．用无菌镊子取一小块固体培养基，置于载玻片上，用接种环在培养基四周接上霉菌孢子盖上盖玻片。4．在培养皿内放入园形滤纸，滴加无菌20%甘油3—4ml。5．在滤纸上放入“U〞形玻璃棒，将制好的玻片置于玻棒上盖上培养皿盖〔图2〕，温箱中培养，注意全部操作必须严格无菌，菌体生长后，取出玻片置显微镜下观察。此法最适合进行放线菌的基内菌丝，气生菌丝孢子丝，霉菌的分生孢子梗，分生孢子，孢子囊柄等的观察。培养皿培养皿““U〞形玻棒载玻片载玻片培养基培养基盖玻片盖玻片滤纸滤纸侧面观侧面观图2小室培养〔二〕根霉接合孢子取黑根霉〔Rnizopusnigricens〕+3.2045－与黑根霉〔Rnizopusnigrleens30℃温箱培养4—〔三〕根霉的假根根霉的气生菌丝遇到基质以外的障碍〔如玻璃壁〕可分化假根。在麦芽汁固体培养基或查氏固体培养基〔以葡萄糖代替庶糖〕平板上点接黑根霉〔Rhizopusnigricans〕孢子每皿可点接6—10处，在28℃温箱倒置〔皿底向上见图3〕培养2—7天，或者在皿盖上放一张无菌玻片。用“在低倍镜或高倍镜下，观察皿盖或玻片可见到假根，孢子囊梗，孢子囊等结构。培养基培养基根霉载玻片玻璃棒图3假根培养〔四〕酵母菌子囊及子囊孢子的形成和观察1、将啤酒酵母〔saccharomycescerevisiac〕接入麦芽汁斜面，25℃—30℃温箱培养24小时。然后移入麦芽汁液体培养基25℃2、取上述液体培养物1毫升移入新的麦芽汁液体培养基中。25—30℃培养24小时，离心〔3000rpm〕5—10分钟，弃上清液用3—3、取上述酵母泥涂于生孢子培养基上〔斜面〕25—30℃培养4—4、制片可观察到子囊及子囊孢子〔可用孔雀石绿及复红染色。子囊红色，子囊孢子绿色〕附：培养基配方：(培养酵母用)〔1〕10Brix麦芽汁〔固体斜面加1.5%琼脂〕〔2〕生孢子培养基NaAC克或NaAC3H2O克Kcl8琼脂2克水100毫升微量元素溶液KI10mgNa2B4O710H2Mncl24H2O3.6mgZnSO47H2O30.8mgCUSO45H2O3.9mg(NH4)6MO7O244H2O1.9mgFe2(SO4)36H2O22.8mg水100mg参加1NHCL到不再混浊为止。〔五〕微生物的检测用教师发给的营养琼脂培养基平板〔如牛肉膏蛋白胨固体培养基马铃薯培养基等〕其中一只平板翻开皿盖在空气中暴露三十分钟，另一只平板，翻开皿盖用揩过桌面的无菌棉签，在培养基外表划线：用自已的手指触摸第三只培养基平板的外表。五、内容1．按教师指定的菌种制小室培养片，培养后观察。2．接种黑根接合孢子平板一只，培养后制片观察配子和接合孢子。3．培养根霉的假根，并观察。4．培养啤酒酵母使之生长子囊和子囊孢子并制片在高倍镜下观察。5．用三只固体营养琼脂平板进行微生物的检测，肉眼观察菌落的形状、大小、色泽、透明度，并区分细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。6．观察示范片a假丝酵母的假菌丝〔以热带假丝酵母candidatropicalls为村料〕b毛霉〔Mucormucedo〕黄曲霉〔Aspergillussp〕青霉〔penicilliumsp〕的标本片。c霉菌菌落平板，注意毛霉、根霉、曲霉、青霉和菌落特征。六、报告〔一〕绘制你所培养的小室培养的微生物的形态并注明各结构的名称。〔二〕绘图表示黑根霉的接合孢子和啤酒酵母的子囊和子囊孢子。七、思考题〔一〕列表表示毛霉、根霉、曲霉、青霉细胞形态结构的异同。〔二〕复习总结实验一至实验四的方法和内容。

实验五微生物细胞大小的测定〔一〕利用台尺、目尺测定微生物细胞的大小一、目的要求了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理；掌握微生物细胞大小的测定方法。二、根本原理微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一。由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用来测量细胞大小的工具有目镜测微尺〔简称目尺〕和镜台测微尺〔简称台尺〕。图4目镜测微尺目镜测微尺是一块园形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分〔图4〕或把10mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物象，由于在显微镜不同的接目镜和接物镜系统下，放大倍数不同，目镜测微尺每格所示长度随显微镜放大倍数而变化，所以在使用前，须用镜台测微尺来校正，求出在显微镜某一接目镜和接物镜系统下，目镜测微尺一格的长度。图4目镜测微尺镜台测微尺形如载玻片，在中央的园形盖片下，有一条长为1mm的刻度，精确等分为100格，每格长10μm。故用长度的台尺校正目尺，即可求出目尺一格的长度。图5镜台测微尺A.镜台测微尺B.放大的尺子三、实验材料1．菌种巨大芽孢杆菌或杀螟杆菌染色片；酵母菌水浸片。2．器材目镜测微尺，镜台测微尺，显微镜，双层瓶，擦镜纸。四、实验步骤〔一〕目尺校正1．将目镜测微尺小心地装入接目镜的隔板上，使刻度向下，把镜台测微尺置于载物台上，使刻度向上，用弹簧夹夹稳。2．先用低倍镜观察，调节工作距离，从视野中看清镜台测微尺的刻度后，移动推动器并转动目镜，使目镜测微尺的刻度和镜台测微尺的刻度平行。3．用推动器定位，使两尺重叠，先使两尺一端的“0”4．数出两重合刻度间目镜测微尺的格数〔N〕和镜台测微尺的格数〔N1〕。台尺每格长度是10μm，故目尺每格之长度X即可求得：X=5．先在低倍镜下校正后，随即用推动器把台尺的刻度移到视野正中央，然后更换高倍镜。6．同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每格代表的长度。7．校正完毕，取下镜台测微尺，用一张擦镜纸蘸酒精乙醚液少许，擦去油污，再以另一张干净的擦镜纸轻轻擦去残留的酒精乙醚液，然后装入盒内，妥为保存。〔二〕细胞大小的测定1．将细菌染色片或酵母菌水浸片，置于载物台上，用低倍镜和高倍镜找到目的物，把菌体分散均匀的部位移到视野中心。2．在高倍镜下，测量酵母菌细胞的大小。在油镜下，测量细菌细胞的大小。先量出菌体长和宽或直径占有目镜测微尺的格数，再用校正的目镜测微尺每格长度，计算出菌体长度和宽度，计量单位以微米〔μm〕表示。同一涂片上，任意测定10～20个菌细胞，求其平均值，即可代表该菌的大小。五、实验报告将实验结果记录于表1，表2中。表1台尺校正目尺结果物镜目尺格数台尺格数目尺校正值〔μm/格〕10×40×100×表2细菌大小测定记录菌名细胞数123456789101112131415∑平均长宽结果计算长μm=长平均格数×校正值宽μm=宽平均格数×校正值大小表示宽μm×长μm六、思考题1．为什么目镜测微尺必须用镜台测微尺校正？2．在目镜放大倍数固定情况下，改变接物镜，由低倍、高倍到油镜，为什么测出目尺每格之长度愈来愈小。有数码显微镜的可利用的安装的MoticImagesAdvanced3.2软件，进行测量。把所需测量的细胞标本片放置在数码显微镜下后，选择所需物镜，调节粗、细螺旋至清晰物象后，进行微生物细胞大小的自动测量，翻开桌面的MoticImagesAdvanced3.2软件图标后，在工具栏中翻开采集窗口，设置放大倍数与所观察的放大倍数一致，调节根本选项卡中的曝光时间、增益、偏移至视觉适宜程度，单击捕捉按钮，根据需要可在捕捉设置中选择捕捉全图、捕捉区域图，一般选用捕捉区域图，单击该选项后，在界面上选定清晰的图像，按住鼠标左键拖动，单击下方的捕捉图像按钮，这时所捕捉的图像出现在右侧的列表中，最小化原界面后，单击右侧所捕捉的图像“〞，捕捉图像即放大显示，单击处理菜单的分割选项，可选用自动单色分割、自动双色分割，分割处理后，可选用处理菜单中的自动计算或利用测量菜单中的工具进行手动测量，记录显示结果。

实验六显微镜下直接测数法—血球计数板法一、目的要求了解血球计数板的构造、原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。二、根本原理血球计数板测数，一般适用于含菌体较大的单细胞的悬浮液，如酵母菌、霉菌孢子等，假设有杂菌或杂质，那么较难识别。对个体小的细菌也不易辨清，必要时，可采用彼德罗夫一霍瑟〔petroff—Hausser〕细菌计数板，即可在油镜下计数。图6血球计数板A图6血球计数板A.平面图B.断面图1.中央平台2.盖玻片血球计数板为一特制的厚型载玻片，在其中部有三条玻璃台〔a,b,a1〕，b台上刻有一对每边长1mm的大方格，大方格各边分为20等分，因此1mm2的大方格，等分为400个小方格〔图7〕。a,a1台比b台高出，所以加盖玻片后，从盖玻片到b台台面之高度〔即液层深度〕也是，由以上数据可得出：大方格面积=1mm×1mm=大方格体积=1mm2×0.1mm=一个小方格体积=mm3：1m1体积=10mm×10mm×10所以，1m1体积中应含有小方格数==1000×4000=4×106个小方格即系数K=4×106因此，每m1菌悬液中含有细胞数=K×d×K：4×106d：菌液稀释倍数：一个小方格中细胞平均数。由上可知，用血球计数板在显微镜下直接测数时，首先数出一个小方格〔〕均质菌液中的细胞数，然后根据公式求得1m1菌液中的细胞数。三、实验材料图7b台网格放大图1．测试样品酵母菌液或细菌悬液。图7b台网格放大图2．器材血球计数板，盖玻片〔22mm×22四、实验步骤1．准备工作〔1〕取血球计数板一个，用无菌滴管吸取摇匀的菌悬液少许，滴在b玻璃台网格上，不要使a，a1玻璃台沾上菌液，以免加盖玻片后，造成b台上液层深度的误差。〔2〕取干净的盖玻片一张，盖在a，a1玻璃台上，勿使产生气泡，使多余的菌液流入a，b和a1，b玻璃台间之液槽内，静置数分钟，使菌细胞沉积于平面上。2．镜检测数〔1〕将血球计数板置载物台上夹稳，先用低倍镜找到方格位置，再用高倍镜测数，由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光的亮度。〔2〕在高倍镜下，观察五个视野，每个视野任意计数五个小方格内之细胞数。位于小方格四边的压线细胞，只计两边，另两边不计；对于出芽的酵母，以芽体与细胞接近大小时，按二个菌体计数。然后求出一个小方格的细胞平均数〔〕。在观察时，应充分运用微动螺旋，以便观察到处于不同液层的细胞，以减少误差。〔3〕测数完毕，取下盖玻片，用清水把血球计数板冲洗干净，用吸水纸轻轻吸去台上附着的水分，再用擦镜纸小心地吸干计数板，注意勿使网格受到磨损，然后放入盒内保存。3．计算将值代入公式，求出每m1〔g〕菌液中的细胞数。五、实验报告计算并报告所测样品每m1〔g〕的含菌数。六、思考题1．系数K值是如何求得的？2．血球计数板的显微镜直接测数法有何优缺点？

实验七培养基的制备与灭菌一、目的：学会一般培养基的制备原理、方法、掌握培养基及器皿的灭菌方法。二、原理：培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质用人工方法配制而成的基质。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐外，还需要各种必要的维生素，以提供能源，组成菌体细胞的原料及调节代谢活动，由于不同微生物营养类型不同，对营养物质的要求也各不相同。因此，需提供不同种类的培养基，一般培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基。培养基除了要满足微生物所要求的各种营养条件外还应保证微生物所需要的其他生活条件，如适宜的酸碱度、渗透压等。因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的PH范围。如：细菌、放线菌培养基偏碱、霉菌、酵母菌培养基偏酸。根据研究的不同，可以将培养基制成固体半固体和液体三种形式，固体培养基的成分与液体相同，仅在液体培养基中参加凝固剂作支持物，通常参加1%的琼脂。半固体参加0.%琼脂作支持物，有时也可用明胶或硅胶。三、材料与用具〔一〕材料：马铃薯、蔗糖、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、琼脂、NaCI、KNO3、K2HPO4、、MgSO47H2O、FeSO47H2O、NaOH、HCI〔二〕用具：试管、锥形瓶、漏斗、量筒、移液管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、PH试纸、铁架台、漏斗架、止水夹、电炉、台秤、硫酸纸、药匙、防潮纸、线绳、标签纸、剪刀、解剖刀、镊子、白瓷盘、〔比色盘〕铁丝筐。四、方法〔一〕培养基的制作方法1．称量：按照培养基的配方，准确称取各成份于烧杯中。2．溶化：向上述烧杯中参加所需要的水量，搅动，然后加热使其溶解，用豆芽或土豆等配制的培养基，须先将豆芽或土豆按其配方的浓度和加热煮沸半小时〔土豆须先削皮〕并用纱布过滤，然后参加其它各成份继续加热使其溶化，补足水分，如果配方中含有有淀粉，那么需先将淀粉及其他药品加热溶化并补足水分。3．调节pH值：初制备好之培养基往往不能符合所要求的pH值，故需要酸度计，pH试纸或用氢离子浓度比色计来矫正，用0.1NNaOH或1NHCI调至适宜的范围。4．过滤：用滤纸或双层纱布〔中间夹一层脱脂棉花〕趁热过滤。5．分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管或三角瓶内，管〔瓶〕塞上棉塞。〔1〕液体：分装高度以试管高度的四分之一左右为宜。〔2〕固体：分装试管，每管为管高五分之一，灭菌后制成斜面，分装三解瓶的容量以不超过三角瓶一半为宜，倒平板每管装15毫升。〔3〕半固体；分装试管一般以管高度三分之一为宜。灭菌后垂直待凝成半固体深层琼脂。6．灭菌：高压蒸汽灭菌，一般培养基

1.05公斤/厘米220-30分钟；含糖培养基为公斤/厘米2米〔二〕根据配制培养基的步骤。按以下培养基配方配制培养基。图8培养基的分装1．牛肉膏蛋白胨培养基〔培养细菌用〕图8培养基的分装牛肉膏0.3%蛋白胨1%NaCI%琼脂2%蒸馏水pH—7.42．土豆培养基〔培养霉菌用〕土豆20%蔗糖2%琼脂2%蒸馏水pH自然3．淀粉培养基〔高氏一号〕〔培养放线菌用〕可溶性淀粉2%K2HPO40.05%MgSO47H2O0.05%KNO30.1%NaCI0.05%FeSO40.001%琼脂2%蒸馏水pH—附：加%琼脂可制成半固体培养基。〔三〕培养基制作考前须知1．加热溶化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其他固体物质粘在烧杯底上烧焦，以致烧杯破裂，加热过程中所蒸发的水分应补足。2．pH值必须按各种不同培养基的要求而准确测定。3．所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质器皿。4．分装培养基时，注意不得使培养基在瓶口或管壁上端沾染，以免浸湿棉塞，引起杂菌污染。5．培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证杀菌效果和不损失培养基的必要成分，培养基灭菌后，必须放在37℃〔四〕棉塞制作和制备原那么棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重要的一环，正确的棉塞是形状、大小、松紧与试管〔或三角瓶〕完全适合，过紧时阻碍空气流通，操作不便。过松时，空气会毫无障碍地进入试管〔或三角瓶〕中，达不到灭菌的目的。棉塞过小往往易掉进试管内，正确的棉塞头较大，约有1/3在外，2/3在试管内。〔五〕灭菌1．培养基的高压蒸汽灭菌〔1〕需灭菌的物品，棉塞等用防潮纸包好〔防止锅内水汽把棉塞淋湿〕，放入灭菌锅内，放入锅的材料要摆的疏松，不可太挤，否那么阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。〔2〕关闭灭菌锅盖旋紧压盖，切勿漏气。〔3〕翻开冷气开关，以排除锅内冷空气和管道冷凝水。〔4〕慢慢翻开进蒸汽口，不要使蒸汽过猛地冲入锅内，排除一局部冷气，关闭排气开关，先使夹套升温至力表公斤/厘米2，再使内层压力升至公斤/厘米2，然后启开排气开关，使夹套及锅内冷气除尽。〔5〕关闭排气开关后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至121℃，压力达1.公斤/厘米2，保持20〔6〕灭菌完毕，关闭进汽开关，待压力降至“0〞时，翻开排气开关，注意不能翻开过早，否那么突然降压致使培养基沸腾，使棉塞沾污，甚至冲出容器以外。〔7〕翻开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。2．干热灭菌法常用于空玻璃器皿的灭菌，但凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用于干热法灭菌，进行灭菌时，先将要灭菌器皿〔培养皿、移液管的包装方法见示范〕包好，放入烤箱内，调节温度至于160—170℃，维持1—2小时，〔当温度升至80℃以上切勿翻开烤箱，以免引起玻璃器皿破裂和火灾〕。灭菌后，当温度降至30—40五、内容〔一〕按教师指定的小组，每一小组制一种培养基300毫升，其中200毫升分装于2—3个锥形瓶中，另外100毫升装入试管，制成斜面，灭菌。〔二〕每一小组制备无菌水1瓶〔100毫升锥形瓶中加水99毫升，内装少许玻璃珠〕，制备无菌水试管4支〔每支试管加水9毫升〕灭菌。〔三〕每一小组准备1毫升移液管5支〔吸口处塞入棉絮〕培养皿12套干热灭菌。六、报告七、思考题〔一〕什么叫培养基？有什么作用？培养微生物的培养基应该具备哪些条件？〔二〕培养微生物能否用同一培养基？细菌，放线菌，霉菌的培养基有何异同？培养基为何要调节pH值？所用微生物培养基最适pH值是否相同？〔三〕培养基为什么要灭菌后再用？可否用橡皮塞，木塞代替棉塞？〔四〕如何检查所配好的培养基是无菌的？

实验八微生物学中的接种技术一、目的要求了解微生物工作的根本接种法，建立纯培养技术中的“无菌〞概念，掌握无菌操作技术。二、根本原理接种是微生物学实验技术中最根本的操作，即把已获得的纯种微生物，于无菌条件下移植于新鲜的无菌培养基的过程。在微生物的菌种保藏、别离培养、鉴定菌种，以及形态、生理等研究中，都必须进行接种。接种时，接种者须有强烈的“无菌〞概念，才能做到严格的无菌操作。无菌概念指的是严防外界杂菌侵入研究体系的思想概念。无菌操作即防止外界杂菌污染，保证纯培养的技术操作。假设操作不慎，污染杂菌，将导致实验失败或损坏菌种。常用的接种工具有接种环、接种针、吸管、滴管、玻璃刮铲等；常采用的接种方法有斜面接种、液体接种、穿刺接种和平板接种等。三、实验器材1．菌种葡萄球菌、大肠杆菌斜面菌种。图9接种工具1．玻璃刮铲2．滴管3．吸管4．接种针5．接种环图9接种工具1．玻璃刮铲2．滴管3．吸管4．接种针5．接种环四、实验步骤〔一〕接种工具准备常用的几种工具〔如图9〕。1．接种针、接种环、接种钩由金属丝和柄组成。金属丝要求软硬度适宜，传热和散热快，不易氧化。一般常用铂金丝、镍丝，也可用直径左右的细电炉丝、铅丝代替。柄常用铝棒和胶木棒做成〔市面有售〕，也可用车条、玻璃棒代替。图10吸管包装法3．吸管在枯燥洁净的吸管上端1～2cm图10吸管包装法4．滴管用纸条包裹，干热灭菌备用。〔二〕接种方法1．斜面接种法把各种培养条件下的菌，接入斜面上〔包括从试管斜面、培养基平板、液体纯培养物等把菌移于斜面培养基上〕。这是微生物学中的最常用、最根本的技术之一。接种前，需在待接种试管上贴好标签，注明菌名及接种日期。接种最好在无菌室或无菌箱内进行，假设无此条件，可在较清洁密闭的室内进行。室内应事先消毒，桌面要清洁，除去灰尘和杂物，用5%来苏儿溶液擦洗桌面。本次用试管斜面菌种接入新鲜的斜面培养基上进行练习，其根本操作方法及考前须知见图1—26。①点燃酒精灯，灯焰周围约1～2cm处在空间为无菌区，所以在酒精灯焰旁进行无菌操作法接种，可防止杂菌污染。②将菌种及接种用的斜面培养基〔即两支斜面试管〕同时握在左手中，使中指位于两试管之间。管内斜面向上，两试管之口平齐，两管处于接近水平位置，用右手的小指，无名指及手掌，在火焰旁同时拔去两支试管的棉塞，并使管口在火焰上通过，以烧去管口之杂菌。随后把管口移至火焰近旁约1～2cm处〔见图11，〕。③右手拿接种环，先垂直、后水平方向把接种环放在火焰上灼烧。凡需进入试管的杆部均应通过火焰灼热，下端的环心须烧红，以彻底灭菌。灼烧时，应把环放在酒精灯之外焰〔氧化焰〕上，因外焰温度高，易于烧红〔见图11，1〕。④将烧过的接种环伸入菌种管内，先使环接触斜面上端的培养基或管壁，使接种环充分冷却，待培养基不再被接种环融化时，即可用环伸向斜面中部蘸取少量菌体，然后小心地将接种环从试管内抽出。注意不能让环接触管壁和管口〔图11，4〕。取出后，接种环不能通过火焰，在火焰旁抽出并迅速伸入新培养基管内，在斜面下1/5处，由下至上轻轻划线。注意不要把培养基划破，也不要把菌沾在管壁上。此过程要求迅速、准确完成。⑤接种完毕，试管口须迅速通过火焰灭菌，在火焰旁塞入棉塞〔图11，5〕。注意不要使试管离开火焰去迎棉塞，以免进入带菌空气。操作中如不慎棉塞着火，只要迅速塞入试管内，由于缺氧火自然就会熄灭。假设棉塞外端仍然着火，也不要用嘴吹，迅速用手捏几下棉塞，即可熄灭。⑥划线完毕，接种环要灼烧灭菌〔图11，6〕，才能放回原处，以免污染环境。放回接种环后，再进一步把试管的棉塞塞紧。置28℃下培养2～3d图11斜面接种程序1.接种针灭菌〔外焰处〕2.拔棉塞3.管口灭菌4.接种5.塞棉塞6.接种针灭菌2．液体接种法是将纯种微生物接入液体培养基的方法。在测定微生物生理特性及其代谢产物以及进行扩大培养时，常需将菌种接在液体培养基内进行培养。以下介绍从斜面及从培养液中把菌种接入液体培养基的方法。①由斜面接入液体培养基中其无菌操作过程与接入斜面的步骤根本相同。但此时所拿的装有液体培养基的三角瓶或试管不能放平，管口要略向上倾斜，以免培养液流出。在火焰旁拔出棉塞后，用接种环在固体斜面上蘸取少许菌种，同样要迅速移入液体培养基中，但无需把接种环伸至培养液之底部，而是把带菌的接种环在液体外表与试管壁交界处轻轻摩擦几下即可。某些不易产生孢子的放线菌或真菌，在培养基上由于菌丝，交织生长形成皮膜状培养物，用接种环不易挑起，可用接种铲或接种钩进行移接。②以菌液接入液体培养基中用液体培养物进行转接时，其操作过程与斜面接种根本相同。不同点在于不用接种环，而要用无菌的滴管或无菌吸管进行接种，吸管等要事先灭菌。接种时用吸管从液体菌种中吸取一定量菌液〔吸入量之多少可按需要而定〕，接入液体培养基中。塞紧棉塞即可培养，〔见图12〕图12液体接种法图13菌悬液的混匀A.振荡法B.手搓法图14穿刺接种法根据接种需要也可用斜面制成菌悬液或孢子悬液，再接入液体培养基中。制作悬液的方法如下：在固体斜面上参加1～数毫升无菌水，用接种环把斜面上的菌体或孢子洗下，混匀即成菌悬液。混匀的方法一般是采用振荡法或手搓法〔见图13〕。图14穿刺接种法液体接种中所用的吸管用毕后，要注意不能随便放在工作台上，以免污染环境。可先将吸管放在吸管架上或高玻璃筒的消毒液中，工作完毕，再进行灭菌、清洗。3．穿刺接种即把菌种接入柱状培养基的方法。经常应用的是半固体柱状培养基。此法可用于测定细菌的运动能力。例如，具有鞭毛的细菌接种培养后，在培养基内可见到沿穿刺线位置向边缘扩散，生长成波浪形的混浊形状；也可用于测定细菌的生长与氧的关系，假设此种微生物属好气性，那么只在培养基上部生长，只见穿刺线之上部变混浊；假设属厌气性，那么只见穿刺线之下部变混浊，假设属兼性厌气性，那么沿着整条穿线均可见混浊。此外穿刺接种法还可用于菌种保藏等方面。其接种方法同前，只是不用接种环而用接种直针接种。接种时，用接种针蘸取少量菌体后，直接从培养基中间插入，直插到接近管底但不要穿透培养基，再慢慢按原接种线拔出接种针〔图14〕。切勿搅动以免使接种线不整齐而影响观察，甚至会因用力搅动造成空隙太大进入空气，使结果不准确。接种完毕，试管放入试管架置28℃下培养2～4d4．平板接种法即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用吸管接种定量的菌液至平板培养基上，再用无菌刮铲刮匀，然后培养。观察菌落形态、别离纯化菌种、活菌计数等常采用此方法。根据实验的不同要求，可分以下几种接种法。图15划线法〔1〕斜面接平板图15划线法①划线法用接种环以无菌操作法从斜面菌苔上挑菌少许或以菌悬液接种。方法是用左手托起培养基平板，以拇指和食指夹住皿盖两侧，其余三个手指托住皿底，拇指稍向上掀盖即可翻开一缝隙，右手把已取好菌的接种环迅速由缝隙伸入平板内，在培养基一侧作第一次平行的〔或连续的〕划线。约划4～5条，然后取出接种环灼烧，左手随即将皿盖合上。并将皿向右转60°角，再按上法做第二次划线。划线时接种环须通过第一次划过的一条或二条线，即示稀释第一次接种的细胞，约划3～4条，再转平皿约60˚角，灼热接种环后再作三次划线，同法亦可做第四次划线〔图15〕。接种完毕，灼烧接种环，将皿倒置于28℃图16几种划线方法②点接法一般观察霉菌或酵母菌的较大菌落时多采用。方法是用接种环取菌体后，于平板上以三点〔∴〕的形式接种。由于霉菌孢子轻，易飞扬，宜先配成孢子悬浮液，再进行接种。图16几种划线方法〔2〕液体接平板即用灭菌吸管或滴管吸取定量的菌液接至平板培养基上，然后用无菌刮铲涂匀后，倒置于28℃〔3〕平板接斜面将平板上别离得到的单菌落，按无菌操作法分别移接到斜面培养基上以保存菌种。接种前，先选好典型单菌落，做好标记。以左手托住培养皿，并用拇指与食指掀起皿盖成缝隙，将灼烧过的接种环伸至菌落边的空白培养基处接触冷却，然后挑菌后移出接种环〔靠近火焰无菌区〕，左手放下培养皿，换拿一支斜面培养基按斜面接种法进行接种。接种完毕，置28℃五、实验报告记录几种接种操作练习的实验结果。六、思考题1．何谓无菌操作与无菌概念？二者有何关系？2．总结几种接种技术的要点及考前须知。

实验九菌种保藏一、目的要求了解微生物菌种保藏的重要意义，学习常用的几种保藏法。二、根本原理菌种即微生物的种子。它是人们在长期生产实践和科学实验中，获得和积累下的重要生物资源，象作物品种一样，同时人民生活中不可缺少的珍贵财富，受到世界各国生物学界和医学界的重视。所以菌种保藏已成为本学科一项重要的技术与研究课题。三、实验材料1．菌种葡萄球菌、豌豆根瘤菌、啤酒酵母、5406放线菌、米曲霉等斜面菌种。2．器材牛肉膏蛋白胨琼脂斜面、甘露醇酵母汁琼脂斜面、高氏1号琼脂斜面、马铃薯葡萄糖琼脂斜面、麦芽汁琼脂斜面等培养基，灭菌液体石蜡、固体石蜡、毛笔，剪刀，小试管，吸铁石，麸皮，滤纸，枯燥器、牛奶、安瓿管、离心管、冷冻槽、真空枯燥装置、封口机等。四、实验步验〔1〕斜面低温保藏法此法简便易行，无须特殊设备。即将菌种接种于各自要求的斜面培养基上，待充分生长后，置斜面菌种于4℃1．接种取牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基接种葡萄球菌；取甘露醇酵母汁琼脂斜面培养基接种豌豆根瘤菌；取高氏1号斜面培养基接种5406放线菌；取马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基接种3.0422．培养接种完毕，做好标记，置28～30℃温度下培养2～7d3．保存于不同培养天数后，分别取出各菌放入4℃〔二〕矿油〔液体石蜡〕封藏法此法是在琼脂斜面培养基上覆盖一层液蜡，以隔绝空气。它能抑制生物代谢，推迟细胞老化，防止培养基水分蒸发，因而有延长生物寿命的效果。图22液蜡保藏法1.固体石蜡封口2.棉塞3.液体石蜡4.斜面菌体1．灭菌矿油〔液蜡〕的制备选用化学纯优质液体石蜡〔中性，比重～〕，参加18mm×180mm试管中，每管10～图22液蜡保藏法1.固体石蜡封口2.棉塞3.液体石蜡4.斜面菌体2．培养菌种与斜面接种培养法同。3．灌注液蜡以无菌操作法用无菌吸管吸取灭菌液蜡，注入各种菌的斜面管中，使液面高出斜面顶部1cm，塞好棉塞即可〔图22〕。为保存得更好，可将棉塞剪至与试管口平齐，用镊子将管内棉塞向内推进约，再以干净毛笔蘸取加热融化的固体石蜡，涂滴于管口密封。4．保藏将试管放入试管架中〔或直立状放置〕在4～15℃〔三〕沙土管保藏法适用于形成孢子及芽孢的微生物。即将要保存的菌种，先于斜面培养基上培养，再用无菌水制成细胞悬液，将悬液按无菌操作法注入已灭菌的沙土管中，使细胞或孢子及吸附于沙粒上，置枯燥器中，待吸干沙管中的水分后加以保藏。具体操作如下：1．沙土管的准备取河沙，过60目筛，除去粉粒，置烧杯内，用10%HCI浸泡，以除去有机物，约2～4h后倒去HCI，用清水冲洗数次，至水呈中性为止。淋去水，将沙烘干或晒干，再用磁铁吸去砂中的铁质。将处理好的沙分装于小试管中，装入量高约1cm，塞上棉塞，置160～170℃灭菌2h或高压蒸汽灭菌1h，重复2～3次。灭菌后取沙粒少许，接于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，于28℃下培养2～32．培养菌种与斜面接种培养法同。3．制备菌悬液于各菌的斜面培养管内，注入3～5m14．混菌用无菌吸管吸取菌悬液，于沙土管中参加1〔约10滴〕，然后用接种环充分搅拌，使细胞或孢子与沙土混匀，塞好棉塞，放于枯燥器中。放线菌和霉菌产有孢子，可用接种环直接从斜面上挑取孢子拌入沙土管中混匀。5．枯燥将混匀的沙土管，放入枯燥器中枯燥。器内用玻璃器皿装五氧化二磷或无水氯化钙以吸收水分，待五氧化二磷吸水成糊状时，更换新药，如此数次，砂管即可枯燥。图23沙土保管藏法1.图23沙土保管藏法1.固体石蜡封口2.含菌沙粒3.烧融玻璃法封口7．复活培养法需要菌种时，按无菌操作法取沙粒少许，移入新鲜培养基中，培养后即成。〔四〕麸皮保藏法这是按照传统酿造制曲原理而采用的一种方法，适于某些真菌菌种的保藏。1．麸曲管制作称取新鲜麸皮1份，按麸皮∶水=1∶～加水混拌，稍闷，待吸水均匀后，分装入小试管中，装量约1cm高，装时，要使麸皮以松散状装入管中，并防止沾污管口，必要时须清洁管口、管壁，塞棉塞，包扎成捆，在〔121℃〕下灭菌30min，2．接种培养取米曲霉斜面菌种，用接种环挑取孢子少许接入麸皮管中，摇匀后，28℃下保温培养2～3d3．枯燥将培养好的麸皮菌管，放室温下自然枯燥，20℃4．复活培养法移取麸皮少许于新鲜培养基中，培养后即得新鲜菌种。〔五〕滤纸保藏法将微生物的细胞或孢子吸附在滤纸上，枯燥后加以保存。适用于细菌、酵母菌、霉菌、藻类。1．滤纸管准备将粗滤纸裁成×4cm的小条，装入小试管中，每管1条，在压力下灭菌30min。2．菌种培养取牛肉膏蛋白胨培养液接种细菌；麦芽汁培养液接种酵母菌或霉菌；藻类培养液接种蓝藻或其它藻种。置于28℃下保温培养3～5d3．接种将培养好的菌悬液，用灭管吸管按无菌操作法吸取菌液少许，滴加于灭菌滤纸上2～3滴使其自然下流，塞好棉塞。4．枯燥将接入滤纸条上的菌种小试管放入枯燥器中，以五氧化二磷作吸水剂，使其迅速枯燥，注意及时更换吸水后呈糊状的五氧化二磷。枯燥后仍放枯燥器中保存。或放4℃5．复活培养法用无菌镊子按无菌操作法取滤纸移入各菌相应的液体培养基中，适温培养，即获复活菌种。〔六〕冷冻枯燥保藏法此法是利用有利于菌种保藏的诸因素，使微生物处于低温、枯燥、缺氧的条件下保持其性能。这是当今最有效的保藏法之一。其原理是先将菌细胞冷冻使水形成冰晶，然后在真空下使冰升华以除去大局部的水。不冻结的残留水分，再通过蒸发从细胞中除去。为了减少冻干过程中对细胞的损害，常采用添加保护剂的方法。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清或与蔗糖、谷氨酸钠等搭配而成。本实验是以脱脂牛奶为例进行实践。1．菌种准备将欲进行冻干保藏的菌种接种于培养基上，培养至生长饱满或孢子成熟，待用。2．安瓿管准备选用×10cm规格的中性硬质玻璃安瓿管。先用2%HCI浸泡8～10h，用水冲洗屡次，最后用蒸馏水再洗2～3次，之后置烘箱中烘干。将印有菌名、菌号和接种日期的标签放入安瓿管内，有字的一面贴向管壁。管口塞好棉塞，于MPa下灭菌30min〔图24〕。图24冷冻枯燥法的安瓿管处理1.管瓿管2.标签位置3.含菌悬液图24冷冻枯燥法的安瓿管处理1.管瓿管2.标签位置3.含菌悬液4.棉塞位置5.拉细颈6.熔封4．菌悬液制备取已备好的新鲜斜面菌种，用无菌吸管吸取灭菌牛奶2～3m15．分装用无菌毛细管或长滴管将菌悬液分装入安瓿管底部，每支管装量约1〔4～5滴〕。6．预冻先将致冷剂干冰和乙二醇甲醚〔或乙二醇乙醚、或乙醇、或丙酮〕参加预冻槽内。使槽内温度约在—25～—40℃之间。将安装在歧管上的安瓿管浸入预冻槽内。悬液经数秒至几分钟便可冷冻。〔假设冷冻管数量很大，需维持1h以上〕。图25真空枯燥装置1.枯燥瓶2.安瓿管3.冷冻槽4.枯燥器〔内有无水氯化钙〕5.真空压力表6.抽气机7．真空枯燥预冻后，将安瓿管放入真空器中进行枯燥〔图25〕。在开动真空泵后，应使真空度在15min内到达汞柱，随后逐渐到达0.2～汞柱。此条件下样品将保持冻结状态。当样品根本枯燥后，真空度将高于汞柱，这时样品温度可渐上升〔但不得超过30℃〕，以加速样品中残留水分的蒸发。目视冻干样品呈现松散的片状即符合要求。一般少量样品约需3～4h，可抽干，大量样品那么需8～10h甚至过液。图26封口装置8．封管封管前先将安瓿管棉塞向内推移，然后在棉塞下端处用火焰烧溶拉成细颈。再将安瓿管安装在抽真空的歧管上〔图26〕，继续抽干几分钟后，立即用细火焰从细颈处烧熔，封口。图26封口装置9．检验封好的安瓿管要用高频电火花器检查是否为真空状态。即用高频电花火器射向安瓿管的上端，管内即产生真空放电，假设发生蓝紫色光时，那么说明该管真空度符合要求。逐管检查，合格后即可存放在4℃10．冻干菌复原安瓿管冻干菌适长期保存，一旦需要，即可开封并进行复原。开封时，先用75%消毒酒精消毒管外壁，然后用小沙轮子于管下端锉一道痕，置管口在火焰上烧热，加数滴无菌水引致管口裂破，轻轻敲断。随即用接种环挑取枯燥样品接在新鲜培养基上培养即成。这步需严格无菌操作，否那么易造成被空气杂菌污染的危险。五、实验报告1．记述你进行的几种菌种保藏法。2．简述几种保藏的原理，指明适用保藏哪类微生物。六、思考题菌种保藏工作的重要意义何在？各方法的根本原理是什么？

实验十显微摄影技术一、目的要求学习微生物摄影技术，练习显微摄影方法。二、根本原理显微摄影主要是用摄影机把显微镜下放大的物象，进行摄影记载。它是微生物学研究工作的必要技术之一。显微摄影包括标本片的制作、摄影机的装置、摄影、显影、晒印、放大等技术。本实验只进行摄影练习。三、实验材料1．菌种细菌标本片。2．器材XSA—211型显微镜或普通光学显微镜，FX—3摄影机，135胶卷。四、实验步骤〔一〕常规显微摄影步骤图27显微摄影装置1.感光片2图27显微摄影装置1.感光片2.摄影用目镜3.调焦用目镜4.棱镜5.十字线2．取XSA—211型显微镜或普通光学显微镜一台，放在实验台上，取下显微镜的镜筒，安装上“T〞型园筒，然后取下摄影机镜头，将摄影机的机身安装在“T〞型园筒的顶端〔图27〕。3．将显微镜灯光源插在变压器上，显微镜灯即发亮，然后翻开光圈，使聚光器很明亮。4．将标本片或其它材料安放在显微镜载物台上，先把低倍镜转到镜筒下方，下降到工作距离位置。然后从“T〞型筒侧面观察，调节焦距，直到物象出现。再更换高倍镜观察，在高倍镜下找到物象后把清晰典型物象移到视野中间的“＋〞字线上。5．上升镜筒，将聚光器上升到顶点，开大光圈，在标本上滴一滴香柏油。将油镜头下降浸入油内，再调节粗动螺旋，直到物象出现。用微动螺旋调节清晰，再将典型物象移到视野的“＋〞字中心。6．曝光时间一般在1～4s不等，有时需要更长时间，它与光源强度、照明方法、滤光玻片厚度和颜色浓淡、标本片的颜色、显微镜放大率和胶卷感光性能等有关。因此正式工作前，可进行曝光试验，确定最适合的曝光时间。每次曝光后，随即卷片一张，以免再次摄影时发生重复曝光而使胶片报废。7．显影和晒印：方法与普通的摄影感光片处理同。〔二〕ME—MATIC显微照相机照相步骤1．将软片装入照相机盒内，并将机盒上的拍摄张数计数器的小白点对准零位。2．将照明系统接通电源，开通变压器开关，照明灯发光。3．选择适当物镜及目镜，调整好显微镜照明系统。4．将要照像的标本片置于载物台上，通过物镜调焦，调好后将目镜筒推到一边，这时光线就可以到达照相机机身。5．接通自动曝光定时器，接通电源，指示灯泡发光〔红光〕快门按键发光〔白光〕。6．根据预备实验或已有经验选择适当的曝光数值，并将定时器上曝光指数粗、细调节旋扭旋到所定数值〔由于自动曝光定时器是按曝光量=光强×时间进行设计的，所以当每个标本明暗不同时，仪器会自动调整曝光时间，使拍摄效果一致〕。8．轻按遥控按扭，快门自动翻开，自动关闭。注意快门翻开时，定时器上快门按钮白光熄灭，曝光按钮发光〔绿光〕，同时曝光电表指示针自右端数值9向左移动，在快门关闭时立即向右跳回原处。9．当拍完全部标本，即可取下机盒倒回软片，取出暗盒，再将机盒装回原处，并随即将仪器盖好以防落灰，并切断全部电源。说明：1．本仪器细调每增加一档，相当于曝光时间增加一倍。3．照相机盒上三角尖转至C为开，转至黑点为关闭。转至R为照完后倒胶卷。4．快门刻度表上当三角尖转至T时将快门翻开，即可用定时器控制照相。三角尖转至B为手控时间。5．照像机每拍完一张都应卷片一张。五、实验报告显微摄影包括哪些步骤？你进行的显微摄影效果如何？六、思考题显微摄镜中的曝光试验如何进行？它有什么作用？

实验十一一、目的：了解满足微生物生长发育对营养物质，一定环境条件的要求，了解抑制或杀死微生物的一些物理的，化学的及生物的因素抑菌杀菌的原理并掌握其实验方法。二、原理：微生物的生长发育都要求一定的营养物质。一定的环境条件。营养物质的种类很多，碳、氮、磷、钾等主要营养元素，对微生物生长发育的影响更显著；而微量元素和生长因素也有一定的影响。在培养微生物时，只有满足微生物对营养物质的要求，微生物才能旺盛的生长繁殖。微生物和外界环境处于相互影响的状态中。射线，紫外线可以杀死微生物。也可以引起遗传性状的改变——变异；氧气与细菌生长发育的关系密切；不同类型，不同浓度的化学药品对微生物可以起到营养，抑制，或致死的作用；青霉、放线菌和某些细菌产生的抗菌素可以使微生物受到抑制和致死作用。这些物理的，生物的因素就构成了微生物的环境因素。当外界环境适宜时，微生物进行正常生长、繁殖、不适宜时，那么引起微生物生长抑制、变异、甚至死亡。三、材料与用具：〔一〕材料：1、黑曲霉、枯草杆菌、大肠杆菌、八叠球菌、酵母菌各一支；放线菌A和B平板培养。2、完全培养液、缺氮、缺磷和缺钾培养液分装在三角瓶中灭菌备用。3、不同PH值〔3、5、7、9、11〕肉汁培养液系列灭菌备用。普通培养基、酵母培养基。4、药%HgCl2；碘酒；新洁尔灭〔1:1000〕，5%石碳酸。〔二〕用具：无菌培养器、接种环、打孔器、无菌移液管、涂布棒、黑纸、滤纸园片、紫外光灯等。四、各种不同营养元素对黑曲霉的影响附表一配制不同的营养液〔毫升〕成份完全缺碳缺氮缺磷缺钾蔗糖60666NH4NO333022KH2PO41111mlKCllml(NH4)3PO4混合液11111蒸馏水4107551、配制培养液：20%蔗糖、15%NH4NO3·0.5%KH2PO4、0.5%(NH4)3PO40.5%KCL混合液〔1.2%MgSO4、0.05%NaCl、0.005%FeSO4等量混合〕。2、按附表一规定的数量分别参加100毫升三角瓶中，作好标记在水浴上煮沸15分钟，灭菌备用。3、冷却后，按无菌操作要求，分别接入一环黑曲霉孢子，摇匀，放入28℃〔三〕PH值对微生物的影响1、配制牛肉膏培养液、分别调成PH3、5、7、9、11系列，分装在试管中，每管10毫升。经灭菌备用。2、按试管系列分别接入大肠杆菌一环，作好标记，放入37℃附表二培养基类型菌丝生长情况孢子生长情况生长外观菌膜厚薄菌丝疏密有无生长生长疏密完全培养基缺碳培养基缺氮培养基缺磷培养基缺钾培养基注意：生长外观：有否皮膜、薄膜、绒膜、絮状。生长情况可以：0、+、++、+++来表示。3、将观察结果记入下表：PH值菌名357911简要说明大肠杆菌四、温度对微生物的影响〔任选〕1、取五支普通培养基斜面，直线接种枯草杆菌，另五支同法接种大肠杆菌。2、分别放入0℃、15℃、30℃、373、将观察结果记入下表。〔五〕空气〔氧〕对微生物的影响1、取灭菌后的培养皿二套，分别倒入已溶化并冷至45℃2、待平板冷凝后，分别挑取枯草杆菌和酵母菌少许，在各自的平板上划十字，再用镊子取盖玻片〔沾少许酒精在火焰上烧一下，待冷却后〕盖在所划十字的正中央，〔要露出四端〕，放入28℃〔六〕紫外线对微生物的影响1、取灭菌培养皿一套45℃2、取镊子灭菌后，夹取一张已灭菌的黑色图案纸，轻轻放在培养基上，置紫外光灯下20—30厘米，照射30—40分钟。3、取下黑纸片，盖上皿盖，在37℃〔七〕微生物间的拮抗现象1、取灭菌培养皿二套，分别用灭菌吸管吸取1毫升枯草杆菌和大肠杆菌菌液，放入培养皿中，再倒入已熔化并冷却至45℃2、用打孔器将已培养好的放线菌A和B各取二块，分别放置在两个平板上，放入28℃〔八〕化学因素的影响1、在无菌培养皿底部用特种铅笔注明！“①〞、“②〞、“③〞、“④〞，在皿盖注明实验名称、时间、实验者。2、用无菌操作在培养皿内参加培养18小时的金黄色葡萄球菌悬液1ml，再参加熔化并冷却到45—55℃3、用无菌滤纸片分别沾升汞、碘酒、新洁尔灭、石炭酸四种溶液，将其分别放标有“1”、“2”、“3”、八、作业：1、记录和说明各项实验结果。2、PH值对微生物生长有何影响？3、何谓拮抗关系？拮抗现象是怎么产生的？4、试验紫外线对微生物生长影响时，不开皿盖就使紫外线照射是否可以？为什么？

实验十二葡萄糖的氧化发酵测定一、目的要求了解葡萄糖发酵的原理，掌握其测定方法。二、根本原理在细菌分类鉴定中，糖类发酵产酸是一项重要依据。细菌对糖类的利用有两种类型：一种是利用糖类发酵产酸，不需要以分子氧做为最终受氢体，称为发酵型产酸；另一种那么以分子氧作为最终受氢体，称为氧化型产酸。前者包括的菌种类型为多数。氧化型产酸量较少，常被培养基中的蛋白胨分解产生的氨所中和，而不表现产酸。为区分两种产酸方式，博德和霍尔丁〔Board和Ho1ding〕二氏改用含无机氮的一种培养基，用以鉴别两种产酸类型。这一实验已广泛用于细菌鉴定中。一般以葡萄糖作为糖类代表进行试验。本次实验测定采用封闭与不封闭培养管口的方法，以区别其类型。三、实验材料1．菌种培养18～24h的大肠杆菌和枯草杆菌。2．器材博德和霍尔丁〔Board和Ho1ding〕二氏柱形半固体培养基〔附录五，25〕，灭菌液体石蜡，无菌滴管，接种针，酒精灯。四、实验步骤1．编号每组取10支半固体培养基管，用特种铅笔编号，注明组号和试验日期等。2．接种用穿刺接种法接入幼龄菌种于培养基中，每株菌接4管，其中2管用无菌滴管吸取灭菌液体石蜡封盖培养基外表〔厚度约为0.5～1cm3．培养将培养管置于28℃温度下1d、2d、4d、7d五、实验报告1．将实验结果填于表5中。2．判断测试菌是氧化型产酸，还是发酵型产酸。注：氧化型产酸一仅开管产酸，氧化作用弱的菌株，往往先在上部产碱〔1～2d〕，后才稍变酸。发酵型产酸一开管及闭管均产酸，如产气那么琼脂柱内有气泡出现或发生裂断现象。表5葡萄糖的氧化发酵结果处理开管闭管试管号ⅠⅡⅠⅡ培养时间〔d〕1247124712471247大肠杆菌枯草杆菌对照注：记载符号：○表示产酸，＋表示产气，表示产酸产气。六、思考题糖氧化发酵的两种类型其本质区别何在？

实验十三酒精发酵试验一、目的要求了解酒精发酵的原理，学习发酵试验方法。二、根本原理图31酒精发酵〔艾氏发酵管〕1.发酵前2.图31酒精发酵〔艾氏发酵管〕1.发酵前2.发酵后〔产气〕三、实验材料1．菌种在麦芽汁琼脂培养基上培养3d的啤酒酵母〔Saccharomycescereuisias〕。2．器材酒精发酵液〔附录一，34〕，艾氏发酵管，10%H2SO4，10g/LK2Cr2O7，150g/LNaOH，路哥氏碘液，试管，10四、实验步骤1．发酵液准备取灭菌的艾氏发酵管1支〔图31〕，按无菌操作法倒入灭菌的酒精发酵液，使发酵液充满管部并赶走气泡，液量加至下端球部的1/4处，塞好棉塞，备用。2．接种用接种环接入啤酒酵母菌数环〔要求多量〕，接种时，以接种环放至发酵管壁充分研磨使细胞分散，轻轻振荡，使之混匀。用挂线标签标记后悬于发酵管上。3．培养置发酵管于28℃下培养24～48h4．结果检查〔1〕翻开发酵液棉塞，嗅闻有无酒香味产生，记录之。〔2〕记录发酵液管顶部气体容积，然后用吸管酌情吸出球部发酵液少许弃去，并向管内参加与发酵液等量的150g/1NaOH溶液，轻轻摇动，使管内CO2气体渐被硷液吸收，发酵液面逐渐上升，即证明有CO2CO2＋NaOH→NaHCO3〔3〕取发酵液制成水浸片，检验酵母细胞形态及出芽生殖现象。五、实验报告记述实验结果报告之。六、思考题1．酵母菌的呼吸特点是什么？酒精发酵试验中为何强调要接入多量酵母菌体？2．了解酒精发酵作用有何实践意义？

实验十四淀粉水解试验一、目的要求了解淀粉水解的原理，学习淀粉水解试验方法，检测细菌是否具水解淀粉的能力。二、根本原理许多细菌产生淀粉酶，能水解培养基中的淀粉为无色糊精、麦芽糖、葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝，故可用以鉴定菌是否具水解淀粉的能力。三、实验材料1．菌种培养24～48h的大肠杆菌及枯草杆菌的斜面菌种。2．器材含淀粉的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基〔每管15m1〕〔附录五，20〕，路哥氏碘液、无菌培养皿。四、实验步骤图32淀粉水解作用1.待测菌2图32淀粉水解作用1.待测菌2.透明区3.兰色区3．检查形成菌落后，于平板上滴加碘液数滴，轻轻旋转培养皿，使碘液铺满全皿为度。假设菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解；透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的大小；反之，那么示该菌不产淀粉酶，无水解淀粉的能力。〔图32〕五、实验报告列表记录实验结果报告之。六、思考题淀粉水解的原理是什么？本方法是否适用于所有的微生物？

实验十五石蕊牛奶试验一、目的要求了解石蕊牛奶产生变化的原理，学习细菌鉴定的方法。二、根本原理牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白等，不仅是细菌生长发育的良好培养基，而且可用以测定细菌的生化特性。不同细菌对牛奶各成分的分解利用是不同的，常用石蕊作为酸碱指示剂和氧化复原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈红色，碱性时呈蓝色，复原时自下而上地褪色变白。以此特征来鉴定细菌。细菌对牛奶的作用有六种情况1．产酸—细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。2．产碱—细菌分解酪蛋白产生氨等碱性物质，使石蕊变蓝。3．胨化—细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶变得比拟澄清而略为透明。4．酸凝固—细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红，当酸度很高时，可使牛奶凝固。5．凝乳酶凝固—有些细菌能产生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此时牛奶常呈蓝色或不变色。6．复原—细菌生长旺盛，使培养基氧化复原电位降低，因而石蕊复原褪色。以上所述1—5种反响情况中，石蕊均可复原。三、实验材料1．菌种培养24h的大肠杆菌，枯草杆菌斜面菌种。2．器材石蕊牛奶培养基〔附录五，21〕，接种环四、实验步骤1．接种培养取石蕊牛乳培养基6管，除二管不接种作对照外，其余4管用接种环分别接入大肠杆菌和枯草杆菌，每菌重复2管。接种完毕，置30℃2．结果检查于3d、5d、7d、14d分别观察一次，记录结果。五、实验报告将观察结果填入表6。表6细菌对牛奶的作用结果菌种观察时间〔d〕颜色反响凝乳胨化酸凝固氧化复原产气大肠杆菌135714枯草杆菌135714注：记载符号：有反响＋，无反响－。颜色反响，氧化复原等用文字记录。六、思考题1．怎样区分细菌对牛奶作用的六种反响情况？2．石蕊牛奶试验有何实践意义？

实验十六明胶水解试验一、目的要求了解明胶水解的原理，学习穿刺接种的方法。二、根本原理明胶是一种动物性蛋白，其水解〔液化