杆状病毒表达系统医学课件

1汇报人：AA2024-01-27杆状病毒表达系统医学课件目录contents杆状病毒表达系统概述杆状病毒载体构建与优化昆虫细胞培养技术重组蛋白表达与纯化杆状病毒表达系统应用实例实验操作规范与安全防护301杆状病毒表达系统概述杆状病毒是一类专门感染节肢动物的病毒，具有高度的宿主特异性。杆状病毒粒子呈杆状，由蛋白质外壳和内部的核酸组成。杆状病毒在自然界中广泛存在，对昆虫宿主具有致死性，因此被广泛应用于生物防治领域。杆状病毒简介利用杆状病毒作为载体，将外源基因插入到病毒基因组中，通过感染昆虫细胞实现外源基因的表达。原理杆状病毒表达系统可实现外源基因的高效表达，表达量远高于其他真核表达系统。高表达量昆虫细胞具有与哺乳动物细胞相似的翻译后修饰系统，因此杆状病毒表达系统可表达出具有天然活性的蛋白质。良好的翻译后修饰杆状病毒对人类和非靶标生物安全无害，因此该表达系统具有较高的生物安全性。安全性高表达系统原理及特点生物制药：利用杆状病毒表达系统生产重组蛋白质药物，如抗体、疫苗等。基因工程：用于研究基因功能、蛋白质相互作用等。生物防治：利用杆状病毒表达系统生产生物农药，用于防治农业害虫。前景：随着基因工程技术的不断发展，杆状病毒表达系统将在生物制药、基因治疗等领域发挥越来越重要的作用。同时，随着对昆虫细胞培养技术的深入研究，杆状病毒表达系统的表达效率和产量将得到进一步提高。应用领域与前景302杆状病毒载体构建与优化常用的杆状病毒载体类型包括基于AcMNPV（苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒）和BmNPV（家蚕核型多角体病毒）的载体。载体选择依据根据目标蛋白的性质、宿主细胞的特性以及实验需求来选择合适的载体类型。载体类型及选择通过PCR扩增目的基因，然后将其克隆到杆状病毒转移载体中。基因克隆方法利用强启动子和优化后的密码子来提高目的蛋白的表达水平；同时，可以采用融合蛋白的策略来增强蛋白的稳定性和可溶性。表达策略基因克隆与表达策略载体优化方法启动子优化通过改变启动子的序列或使用多个启动子来提高基因的表达效率。融合标签优化在目的蛋白的N端或C端添加融合标签，如GST、His等，以便于蛋白的纯化和检测。同时，融合标签还可以增强蛋白的稳定性和可溶性。密码子优化根据宿主细胞的密码子偏好性，对目的基因进行密码子优化，以提高蛋白的表达水平。基因组改造通过对病毒基因组的改造，如删除某些非必需基因或插入外源基因，来提高载体的容量和转染效率。303昆虫细胞培养技术Sf9、Sf21、HighFive等常用昆虫细胞系温度27-28℃，相对湿度70%-80%，pH6.0-6.4，振荡培养培养条件常用TC-100昆虫细胞培养基，添加10%胎牛血清培养基昆虫细胞系选择及培养条件细胞密度达到80%-90%汇合度时进行传代传代时机传代方法扩大培养胰蛋白酶消化法或机械刮除法逐步增加培养基体积和细胞接种量，实现细胞数量的快速增长030201细胞传代与扩大培养测定方法MTT法、细胞计数法等测定步骤接种细胞、定期取样、测定细胞数或吸光度、绘制生长曲线结果分析通过生长曲线可以了解细胞的增殖速度、倍增时间等生长特性细胞生长曲线测定304重组蛋白表达与纯化合适的温度是重组蛋白表达的关键，通常选择30-37℃进行诱导表达。温度维持适宜的pH值有助于蛋白的稳定性和溶解度，一般控制在7.0-8.0之间。pH值常用的诱导剂有IPTG等，其浓度需要根据具体蛋白进行调整，以达到最佳表达效果。诱导剂浓度重组蛋白诱导表达条件利用特异性相互作用进行纯化，如抗原-抗体、酶-底物等，具有高选择性和高回收率。亲和层析通过改变pH值或离子强度实现蛋白的分离纯化，适用于不同电荷的蛋白。离子交换层析根据蛋白分子大小进行分离纯化，适用于分子量差异较大的蛋白。凝胶过滤层析蛋白纯化方法比较与选择通过电泳检测蛋白的纯度和分子量大小。SDS电泳利用特异性抗体检测目标蛋白的表达情况。WesternBlot通过质谱技术鉴定蛋白的氨基酸序列和修饰情况。质谱分析检测纯化后蛋白的生物活性，如酶活性、抗体活性等。生物活性测定纯化产物质量评估305杆状病毒表达系统应用实例重组蛋白疫苗生产01利用杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白，用于生产疫苗，如人乳头瘤病毒（HPV）疫苗、流感病毒疫苗等。病毒样颗粒（VLPs）制备02杆状病毒表达系统可表达病毒的结构蛋白，自组装成病毒样颗粒，作为疫苗使用，如乙型肝炎病毒（HBV）VLPs疫苗。疫苗佐剂研究03通过杆状病毒表达系统表达免疫刺激因子，作为疫苗佐剂，提高疫苗的免疫效果。疫苗研发与生产中的应用

基因工程药物制备中的应用重组蛋白药物生产利用杆状病毒表达系统生产重组蛋白药物，如人胰岛素、人生长激素等。抗体药物制备通过杆状病毒表达系统表达抗体或其片段，用于制备抗体药物，如单克隆抗体、双特异性抗体等。融合蛋白药物设计将不同来源的蛋白基因通过杆状病毒表达系统融合在一起，表达出具有新功能的融合蛋白药物。细胞凋亡研究通过杆状病毒表达系统表达凋亡相关蛋白，研究细胞凋亡的分子机制及其与疾病的关系。基因治疗载体研究利用杆状病毒表达系统作为基因治疗载体，将治疗基因导入靶细胞，实现基因治疗的目的。生物传感器开发利用杆状病毒表达系统表达生物传感器相关蛋白，构建生物传感器，用于检测生物样品中的特定分子。其他生物医学领域的应用306实验操作规范与安全防护123未经许可，非实验人员不得进入实验室区域。严格遵守实验室准入制度实验人员必须熟悉并遵守实验室的各项安全操作规程。遵守实验室安全操作规程实验室内应设置明显的安全标识，提醒实验人员注意潜在的危险。注意实验室安全标识实验室安全规章制度遵守03及时处理个人暴露如果发生个人暴露事件，应立即停止实验，按照实验室应急处理程序进行处理。01使用个人防护装备实验人员在实验过程中必须佩戴适当的个人防护装备，如实验服、手套、护目镜等。02注意个人卫生实验人员应保持良好的个人卫生习惯，如勤洗手、不在实验室内饮食等。个人防护措施及注意事项