油莎豆根际土壤中假单胞菌的分离鉴定技术规程

2油莎豆根际土壤中假单胞菌的分离鉴定技术规程本文件规定了油莎豆根际土壤中假单胞菌的分离鉴定的术语与定义，菌株分离、菌株鉴本文件适用于油莎豆根际土壤中假单胞菌的分离鉴定，也可适用于其它一些植物根际土壤中假单胞菌的分离鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本，适用于本文件不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB8538食品安全国家标准引用天然矿泉水检验方法SN/T4624.17入境环保用微生物菌剂检测方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1根际土壤rhizospheresoil植物根系周围、受根系活动强烈影响的距离根系表面数毫米的土壤区域。3.2油莎豆Cyperusesculentus属莎草科莎草属，是多年生草本植物，但栽培品种通常为一年生。3.3假单胞菌Pseudomonassp.直的或弯的革兰氏阴性杆菌，以极生鞭毛运动，不产生芽孢，有机化能异养，呼吸代谢，永不发酵。假单胞菌广泛分布于自然界，如土壤、水、食物和空气中。4菌株分离依据T/SDAQI005中规定先将样品制成溶液，培养基选择依据GB8538中的规定执行。4.1培养基配置3称取49.6g假单胞菌琼脂培养基，加蒸馏水至1L，加入10mL甘油，搅拌均匀，调pH至7.0。121℃灭菌15min。待培养基冷的青霉素、15mg/L的萘啶酮酸和10mg/L的游霉素，混匀，倒平板，4℃避光保存备用。成分配比含量（g/L）明胶蛋白胨酸水解酪蛋白硫酸钾氯化镁溴化十六烷基三甲胺0.2琼脂4.2样本中的菌种分离称取1.5g根际土壤溶于pH7.0的PB缓冲液中，将样品溶液用无菌水十倍梯度稀释至合适浓度（可先做一个预实验，弄清楚合适的稀释倍数）。分别取三个梯度的样品溶液100μL涂平板，30℃培养24h（若菌落太小，可适当延长培养时间）。挑取白色、微黄色菌落表面光滑的疑似菌落。5菌株鉴定5.1过氧化氢酶检验挑取疑似菌落至干净的载玻片上，然后在其上滴加一滴3%的过氧化氢溶液，观察是否有气泡产生，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。5.2革兰氏染色根据SN/T4624.17中第17部分恶臭假单胞菌检验的方法执行。取一滴生理盐水至载玻片上，挑取疑似菌落在盐水中涂布，将玻片在酒精灯火焰上过一遍，用背触摸不烫手时再在火焰上过一遍，反复如此，直至涂片干燥。初染：在已固定的玻片上滴加一滴结晶紫染液，染色1min，水洗。媒染：滴加革兰氏碘液，染色1-3min，水洗。脱色：滴加95%酒精，频频振动玻片，直至无紫色洗出，水洗。复染：滴加沙黄染液，染色半分钟，水洗，用吸水纸吸干水分。用油镜检查，应为红色，杆状。5.316SrDNA鉴定5.3.1DNA提取将革兰氏阴性、过氧化氢酶阳性菌株挑入TSB培养基中30℃过夜培养，提取DNA。测定提取物的浓度及OD260/OD280比值,比值在1.8-2.0间较为合适。5.3.2PCR扩增4利用16SrDNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增。体系（50μlDNA模板4μL，ddH2O1min，72℃90s，35个循环；72℃10min，10℃冷却。5.3.3琼脂糖凝胶电泳配置1.0%琼脂糖凝胶30mL，微波炉加热融化，待冷却至50℃-60℃时，加入1μL核酸染料，倒入模具中，凝固10min。加入5μL2000bpMarker，和6μLPCR产物与6Xloadingbuffer（5:1）混合物，120V跑电泳30min。用凝胶成像仪观察，应在1500bp左右有清晰明亮条带。5.3.4测序利用高通量测序进行测序，在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记来确定DNA的序列。5.3.5序列比对将测序结果在NCBI网站中进行Blast比对。确认疑似菌落是否属于假单胞菌属。5.4RpoD和gyrB基因序列鉴定5.4.1DNA提取同5.3.1。5.4.2PCR扩增利用RNA聚合酶sigama因子（rpoD）基因和DNA回旋酶B亚基（gyrB）基因特异性引物分别进行PCR扩增。rpoD(F:TGAAGGCGARATCGAAATCGCCAA,R:YGCMGWCAGCTTYTGCTGGCA)gyrB(F:TCBGCRGCVGARGTSATCATGAC,R:TTGTCYTTGGTCTGSGAGCTGAA)体系（50μLDNA模板4μL，ddH2O19μL，27F1μL,1492R1μL,M程序：94℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min，10℃冷却。5.4.3琼脂糖凝胶电泳配置1.2%琼脂糖凝胶30mL，微波炉加热融化，待冷却至50℃-60℃时，加入1μL核酸染料，倒入模具中，凝固10min。加入5μL1000bpMarker，和6μLPCR产物与6Xloadingbuffer（5:1）混合物，120V跑电泳30min。凝胶成像仪观察，rpoD和gyr