生化课件三章蛋白质周

第三章第三章主要一．蛋白质概二．氨基酸(重点三．多肽（重点四．蛋白质的结构（重点七．蛋白质的分离纯化与鉴定（重点蛋白质一级结构的蛋白质一级结构的测1953SangerPrize蛋白质蛋白质一级结构测定内 测定蛋白质中氨基酸组成，根据蛋白质分子 多肽链的选择性降解及各肽段的氨基酸顺序测 蛋白质一级结构测定步骤及方N拆选择性水各条肽小肽蛋白质一级结构测定步骤及方N拆选择性水各条肽小肽（至少两组(1)AminoAcids(1)AminoAcidsAnalysisinThenumberandkindsofamino6NHCl,heatingat100oCfor24Automatedaminoacid?AutomatedAminoAutomatedAminoAcid氨基氨基酸标准样品和人类缓激肽水解物基酸组成分析(2)EndGroup(2)EndGroup最重要的是：N-(2)EndGroup(2)EndGroup①2,4－二硝基氟苯（DNFB）SangerN----产物为黄色的DNP-氨基酸。可用乙醚抽提分离，有紫外吸收。可用色谱法进行不能继续对肽链其余氨基酸进行测定PrincipleofDNFB??2222222PrincipleofDNFB??2222222(2)End(2)EndGroup---N-端测定法，常产物为丹磺酰氨基酸。有很强的荧mol。 不能继续对肽链其余氨基酸进行测定PrincipleofDansylChlorideROC+PrincipleofDansylChlorideROC++ROC+ROC(2)End(2)EndGroup肼解(hydrazinolysis)C-端测PrincipleofhydrazinolysisROCOCCN-端氨基PrincipleofhydrazinolysisROCOCCN-端氨基C-端氨基ROCOCH2NH22C-端氨基氨基酸(2)End(2)EndGroup④羧肽酶(carboxypeptidase)C-端测定法，常用肽链外切酶可获得蛋白质C-端残基顺序（较难）目前常用的羧肽酶：A,B,C和YA：大多数氨基酸(除Pro,Arg，Lys外) 羧肽酶羧肽酶法测定氨基酸顺Val-Ser-(3)CleavageofDisulfide(3)CleavageofDisulfide非共价结合：非共价作用力维系，拆分共价结合：二硫键维系，化学方法拆分拆分(3)Cleavageof(3)CleavageofDisulfide8M尿素或6M盐酸胍-巯基乙醇处理，然后用烷基化试剂 问题：你知道上述各种试剂的用途吗 二硫键的断裂方A.巯基还原222323二硫键的断裂方A.巯基还原2223232322O2222二硫键的断裂方B.过甲酸氧化O OC二硫键的断裂方B.过甲酸氧化O OCS2O++OSperformic2COCO(4)CleavageofPeptide(4)CleavageofPeptide蛋白水解酶（proteolytic----能预测---胰蛋白酶胰蛋白酶水解LysArg糜蛋白酶糜蛋白酶Phe,Trp,TyrLeu,Met,Asn,His胃蛋白酶（Pepsin酸性条件水解，pH2，适用于胃蛋白酶（Pepsin酸性条件水解，pH2，适用于二硫键位置水解Phe,Trp,Tyr，LeuR1ProPheTrpTyr，Leu R2 R3 R4(4)Cleavageof(4)CleavageofPeptide(CyanogenMechanismfortheCleavageofaPeptideBondMechanismfortheCleavageofaPeptideBondbyCyanogenBromide(TobeMechanismfortheCleavageofaPeptideBondbyMechanismfortheCleavageofaPeptideBondbyCyanogenBromide高丝氨酸(TheWhywon’tcyanogensbromidecleaveatcysteineresidues?性(5)Analysisof(5)AnalysisofPeptide称Edmanchemicaldegradation,又称PTHN-端分产物：PTH-aminoacidEtOAc萃取，色谱鉴适用于较小肽段（一般50）法原?(Tobe法原?(Tobe法原分(The法原分(The试剂、样品流入管试剂、样品流入管顺设计原玻璃纤维图析试剂、产品流出管蛋白质一级结构的测(6)Reconstructing蛋白质一级结构的测(6)ReconstructingtheProtein’s的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸(7)Determining(7)DeterminingthePositionofDisulfide过甲酸处理与其它方法分析的肽段进行比对，确定硫键的位置(7)DeterminingthePositionofDisulfide(7)DeterminingthePositionofDisulfideA2301GHI31has38amino21VW 2L222aminofour31threeN(Asn)isaminoterminalA2301GHI31has38amino21VW 2L222aminofour31threeN(Asn)isaminoterminaldisulfideT-T-placedatN-T-cleavewith separatefragment; sequenceonsequenatorT-T-palcedatC-T-(tobeC-overlapscleavewithBrCN;seqaratefragment;sequenceonsequenatorC-C-T-T-themtobeC-T-T-T-T-C-C-C-C-overlapscleavewithBrCN;seqaratefragment;sequenceonsequenatorC-C-T-T-themtobeC-T-T-T-T-C-C-C-C-N-（The一级结构研究一级结构研究方法新技①Sequancingbymass---<25aminoacid---FAB(FastAtomBombardment,快原子轰击(ElectrosprayIonization电喷雾tandemmassspectrometer(MS-MS)---canbeusedtosequence---cananalyzetheblockedN-TandemTandemMass一级结一级结构研究方法新技②RecombinantDNA---Principle:DNAsequencedecidetheproteinsequence---confirmthedirectprotein---ProteinsequencingandDNAareusedtogethertodeterminethecompletesequenceofaprotein四、The四、TheStructuresof3.Secondary蛋白质二级结构：指肽链的主链在空间的排列。它只涉及肽链主链的构象及链内或肽链主链的构象是由肽键的特殊结构决定的。在肽链中，由于C-NC-C键可以自由旋转，在保持肽键平面结构不变的条件下，能够形成不同的空间排列扭角扭角一个肽平面围绕N1-C旋转的角度用一个肽平面围绕C-C2旋转的角度用扭角（f扭角（f，y）决定相邻肽平面的相对蛋白质二级结构中蛋白质二级结构中的氢主链中的—和—N-在各种可能的构象中，能够形成氢键最多蛋白质二级结构的类蛋蛋白质二级结构的类蛋白质二级结构主要有-helix(螺旋有规则（重复）-pleatedsheet(折叠-turns(转角无规则（非重复）(1)-各肽平面围绕同一轴旋转，形十(1)-各肽平面围绕同一轴旋转，形十链内氢键的取向几乎与轴平行，第n个氨基酸残基的-CO基与第n+4个氨基酸残基的-多为右手-螺旋一(1)(1)-影响-helix形成的因影响-helix形成的因电荷侧链大---刚性＋无链内氢---产生“结节(2)(2)-pleated-折叠结构中的每条肽链称作-R-pleated-pleatedParallelParalleland-pleated(3Turn转角andloop凸环Connected-(3Turn转角andloop凸环Connected--backtoitself,producingthenativestructure.1/3AAinatypicalproteinarefoundinsuchnonrepetitivestructuresasturnsandloops.-turn（--turn（-转角弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和四个残基的–N-之间形成氢键个比较稳定的环状结构由于GlyPro结构的特殊性，常常出现两种主要4433=-两种主要4433=-==-=2211字母，所以称环。两末端间距离较小，约为0.371.0nm。拉氏图（Ramachandran拉氏图（Ramach