动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因blaNDM PCR检测技术规程

3.2缩略语动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因blaNDMPCR检测技术规程本文件规定了动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因blaNDMPCR检测技术的术语和定义、检测原理、检测条件、检测方法和结果判定等。本文件适用于动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因blaNDM的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义、缩略语3.1术语和定义以下术语和定义适用于本文件。3.1.1新德里金属-β-内酰胺酶（NDM）新德里金属-β-内酰胺酶（NDM）是一种金属-β-内酰胺酶（MBL能水解大多数β-内酰胺类抗生素（包括碳青霉烯类但不包括单环内酰胺类（例如氨曲南）。碳青霉烯类抗生素是治疗由大部分革兰氏阴性菌引起的严重感染的主要抗菌药物，临床上可用的β-内酰胺酶抑制剂（包括阿维巴坦、克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦）不能抑制NDM水解活性。NDM-1在2008年首次从一名在印度新德里住院的瑞典患者身上分离出的肺炎克雷伯菌中被发现。目前已在肠杆菌科、不动杆菌和假单胞菌等多个物种中发现了NDM-1，并已鉴定出31种NDM变体。3.1.2聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，可看作是生物体外的特殊DNA复制，其最大特点是能将微量DNA大幅增加。PCR技术能够检测和鉴别同菌种不同基因型的菌株，跟踪耐药基因的转移和传播，是分子流行病学调查研究的基础方法。以下缩略语适用于本文件。SS：SS琼脂（SalmonellaShigellaAgar）BHI：脑心浸出液肉汤（BrainHeartInfusionBroth）Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）TBE：Tris-硼酸-EDTA缓冲液TE：Tris-EDTA缓冲液4原理通过对blaNDM基因的序列分析，利用PrimerPremier6.0软件设计并合成了1对特异性引物，建立了动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因blaNDMPCR检测技术规程。通过反复试验确定引物的最佳退火温度为55℃,该引物具有良好的特异性、稳定性和重复性。用所建立的方法对40株山东地区鸡源奇异变形杆菌中碳青霉烯类耐药基因blaNDM进行检测分析。5试剂与耗材5.1美罗培南（MEM）5.2SS琼脂（按照附录A.1配制）5.3BHI肉汤（按照附录A.2配制）5.41mol/LTris-HCl，pH8.0（按照附录A.3配制）5.50.5mol/LEDTA，pH8.0（按照附录A.4配制）5.6TE缓冲液（按照附录A.5配制）5.710×TBE电泳缓冲液（按照附录A.6配制）5.8琼脂糖凝胶（按照附录A.7配制）5.92×TaqMasterMix(DyePlμs)5.10DL2000PlμsDNAMarker5.13GoldView核酸染料5.14NDM特异性引物5.15八连管5.16离心管（0.2mL、1.5mL）6仪器与设备6.1立式高压蒸汽灭菌器6.2生化恒温培养箱6.3立式空气恒温振荡培养箱6.4PCR仪6.5琼脂糖凝胶电泳仪6.6凝胶成像系统6.7微波炉6.8微量移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL）6.9冷冻离心机：离心力≥12.000g6.10水浴锅6.11电子天平：精度0.1g、0.01g、0.001g7检测方法7.1样品准备将奇异变形杆菌直接划线于SS琼脂平板（含有1μg/mL亚胺培南37℃孵育16-18h，选择挑取单个黑色中心菌落接种至含1mLBHI肉汤的1.5mL离心管中。7.2样品DNA提取将含1mLBHI肉汤的1.5mL离心管12,000rpm4℃冷冻离心10min，弃上清，加入200μLTE缓冲液重悬沉淀，放入100℃沸水中煮至少10min，取出后立即冰浴10min，1rpm4℃离心5min，取上清液即为样品DNA。7.3PCR检测以提取的样品DNA为模板进行PCR反应，同时设置阳性对照（含NDM耐药基因奇异变形杆菌提取的DNA）、阴性对照（不含NDM耐药基因奇异变形杆菌提取的DNA）及空白对照（不含模板DNA）。具体PCR检测方法见附录B。8结果判定8.1阳性对照经PCR扩增反应后出现984bp大小的条带，而阴性对照和空白对照不出现任何条带，试验结果成立，反之不成立。8.2在试验结果成立的前提下，样品DNA扩增出与阳性对照一致的984bp条带，则说明菌株中存在NDM耐药基因，否则说明不存在NDM耐药基因。9注意事项采样及检测过程中应注意个人防护，戴口罩和手套、穿工作服：在无污染环境中操作，及时清理物品，用75%酒精对操作区域消毒处理，废弃物经高压灭菌后按有关规定处理。附录A（规范性）相关试剂的配制A.1SS琼脂培养基准确称取牛肉粉5.0g，示月腺5.0g，乳糖10.0g，3号胆盐8.5g，枸橼酸钠8.5g，硫代硫酸钠8.5g，枸橼酸铁1.0g，中性红0.025g,煌绿0.00033g，琼脂17.0g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，室温调pH值至6.9-7.1，加热至煮沸，不必高压蒸汽灭菌，冷至45-50℃倒成平板。A.2脑心浸出液肉汤（BHI）培养基准确称取胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.5g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠(12H2O)2.5g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，室温调pH至7.4±0.2，121℃高压灭菌15min，备用。A.31mol/LTris-HCl，pH8.0157.6gTris-HCl溶于800mL超纯水中，室温调pH至8.0，加水至终体积1000mL，高压灭菌。A.40.5mol/LEDTA，pH8.037.22gNa2EDTA.2H2O溶于160mL超纯水中，加10mL10mol/LNaOH调pH至8.0，加水至终体积200mL，分成数份，高压灭菌。A.5TE缓冲液（10mMTris-HCl：1mMEDTA）10mL1mol/LTris-HCL，pH8.0，2mL0.5mol/LEDTA，pH8.0，灭菌超纯水稀释至1000mL。A.610×TBE电泳缓冲液，pH8.3108gTris-base（0.9mol/L55g硼酸（0.9mol/L加入40mL0.5mol/LpH8.0EDTA储存液（0.02mol/L溶于1000mL灭菌的超纯水中，高压灭菌。A.7琼脂糖凝胶（15g/L）称取1.5g琼脂糖，加入10×TBE电泳缓冲液100mL，微波炉中加热至琼脂糖完成溶解。附录B(规范性附录)奇异变形杆菌NDM耐药基因PCR检测方法B.1奇异变形杆菌NDM耐药基因特异性引物NDM-F:5’-ССААТАТТАТGСАСТСТGТСGС-3’NDM-R:5’-ТСАGТGТАGСТТGТСТGССАТGТ-3’B.2PCR扩增按下列组分制备PCR反应体系30μL，同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照，具体反应体系见表B.1。将下列B.1PCR反应体系中各组分加入八连管中，PCR反应条件为：94℃4℃保存。表B.1PCR反应体系反应组成体积(μL)模板DNA1引物NDM-F1引物NDM-R12×TaqMasterMix(DyePlμs)d