畜禽羽（毛）中利巴韦林及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

1DB36/Txxxx-xxxx畜禽羽（毛）中利巴韦林及其代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法本标准规定了畜禽羽（毛）中利巴韦林及其代谢物1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于猪、牛、羊、鸡、鸭等畜禽羽（毛）中利巴韦林及其代谢物1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺残留量的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3原理试样经甲酸-甲醇溶液提取，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和十八烷基硅烷（C18）分散净化，液相色谱-串联质谱法测定，同位素内标法定量。4试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水GB/T6682规定的一级水标准。4.1.2甲酸：色谱纯。4.1.3乙酸铵：色谱纯。4.2标准品2DB36/Txxxx-xxxx4.2.1利巴韦林（Ribavirin），纯度大于98.0%。4.2.21H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺（TCONH2），纯度大于98.0%。4.2.313C5-利巴韦林（13C5-Ribavirin），纯度大于99.0%。4.3标准溶液的配制4.3.1100mg/L标准储备液：分别准确称取适量的利巴韦林和TCONH2标准物质，用甲醇配制成100mg/L的标准储备液，于-20℃下避光储存，保存期1年。4.3.21mg/L混合标准中间液：分别准确吸取1mL利巴韦林和TCONH2标准储备液（4.3.1）于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀得到1mg/L的混合标准中间液，于-20℃下避光储存，保存期6个月。4.3.3100mg/L内标储备液：准确称取适量的13C5-利巴韦林标准物质，用甲醇配置成100mg/L的内标准储备液，于-20℃下避光储存，保存期1年。4.3.41mg/L内标中间液：用移液管吸取内标准储备液（4.3.3）1mL于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀得到1mg/L的内标中间液，于-20℃下避光储存，保存期6个月。4.3.5混合基质标准工作溶液：根据每种标准的灵敏度和线性范围，移取适量的混合标准中间液（4.3.2）和内标中间液（4.3.4），用空白基质稀释至合适浓度，使用前配置，保存期1个月。4.4材料4.4.1乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）。4.4.2十八烷基硅烷（C18）。4.4.3十二烷基硫酸钠（SDS）4.4.4微孔滤膜（水相）0.22μm。5仪器和设备5.1液相色谱-串联质谱（配电喷雾离子源）。5.2电子分析天平：感量0.1mg。5.3高速冷冻离心机：转速≥5000r/min。5.4涡旋混合器。5.5恒温烘箱。5.6氮吹仪。6试样制备与保存3DB36/Txxxx-xxxx6.1试样制备取适量代表性样品，用1%SDS清洗羽（毛）30min，然后用蒸馏水漂洗3次至清洗干净，于45℃的烘箱中烘干样品，随后剪碎成1-2mm。6.2试样保存常温下放干燥器中保存。7测定步骤称取试样200mg（精确至0.01mg）于50mL具塞离心管中，分别加入20μL13C5-利巴韦林内标中间液（4.3.4）和10mL的2%甲酸-甲醇（2:98，V/V）溶液，置于65℃2h，取出，涡旋1min，超声15min，在5000rpm下离心5min，取上清液备用。7.2净化在上述上清液中加入150mgPSA和150mgC18吸附剂，涡旋30s，然后在5000rpm下离心5min，转移上清液并在45℃条件下氮气吹近干，残渣用1mL0.1%甲酸水溶液溶解，过0.22μm的滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.3色谱条件7.3.1液相色谱条件a）色谱柱：ZORBAXSB-Aq（100mm×3.0mm，1.8μm）。b）流动相：流动相A为2mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1％甲酸），流动相B为甲醇。c）流速：0.4mL/min。d）柱温：35℃。e）进样量：5.0μL。f）流动相和梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱条件时间/min流动相A/%流动相B/%002.503.52986298707.3.2质谱条件4DB36/Txxxx-xxxxa）离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）。b）毛细管电压：3000v。c）干燥气温度：150℃。d）干燥气流量：15L/min。e）雾化气压力：35psi。f）鞘气温度：300℃。g）鞘气流量：11L/min。h）检测方式：多反应监测（MRM），监测条件见表2。表2多反应监测（MRM）条件被测物名称及内标名称定性离子对定量离子对碎裂电压碰撞能量/ev（m/z）（m/z）245.1/113利巴韦林245.1/96245.1/1133803020TCONH23802513C5-利巴韦林250/113250/11338087.4定性测定被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准校准溶液中对应浓度标准校准液的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度相近的标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%>50>20~50>10~20≤10允许的最大偏差/%±20±25±30±507.5定量测定5DB36/Txxxx-xxxx内标法定量：用标准工作溶液分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，标准工作液和待测工作液中利巴韦林和TCONH2的响应值均应在仪器线性响应范围内，色谱图参见附录A。7.6回收率阴性样品中添加标准溶液，按照7.1~7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果与计算试样中利巴韦林和TCONH2的残留量按式（1）计算，计算结果需扣除空白值。式中：X——样品中利巴韦林或TCONH2残留量(μg/kg)；Cs——利巴韦林或TCONH2标准工作液的浓度(μg/L)；Csi——利巴韦林或TCONH2标准工作液中内标物13C5-利巴韦林的浓度(μg/L)；Ci——试液中内标物13C5-利巴韦林的浓度(μg/L)；As——利巴韦林或TCONH2标准工作溶液的峰面积；A——样品中利巴韦林或TCONH2的峰面积；Asi——利巴韦林或TCONH2标准工作溶液中内标物利巴韦林或TCONH2的峰面积；Ai——样品中13C5-利巴韦林的峰面积；V——样品定容体积(mL)；m——样品称样量(g)。9检测方法的灵敏度、准确度和精密度本方法的检出限为0.2μg/kg。6DB36/Txxxx-xxxx本方法的定量限为0.5μg/kg。9.2准确度本方法在0.5μg/kg~5.0μg/kg添加浓度水平上的回收率为92.7%~108.5%。9.3精密度本方法相对标准偏差≦11.21%。7DB36/Txxxx-xxxx附录A（资料性附录）色谱图利巴韦林、1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺和13C5-利巴韦林的多反应监测（MRM）色谱图，见图A.1123图A.1利巴韦林、1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺和13C5-利巴韦林总离子流图（峰1:1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺，峰2:为利巴韦林，峰3:为13C5-利巴韦林）8DB36/Txxxx-xxxx附录B（资料性附录）回收率利巴韦林和1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺添加浓度及平均回收率结果，见表B.1。表B.1鸡羽毛和猪毛中添加不同浓度利巴韦林和1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺平均回收率结果（N=6）添加浓度(μg/kg）平均回收率/%1H-1