酶与酶工程课件

抗體酶

Abzyme一概述二機制三製備四應用

1946年,諾貝爾獎二次得主美國化學家LinusPauling提出酶催化反應的過渡態理論：酶催化化學反應的機制在於：酶能與高能、短壽命的過渡態（激發態）相結合，在這個處於反應底物和產物之間的過渡態構型中，某些鍵斷裂而另一些鍵形成，從而大大降低了化學反應的活化能。

一、抗體酶的發現與研究思路

酶的催化機理是降低活化能

能與過渡態結合的抗體也具有酶的性質

根據Pauling理論，WilliamJencks於1969年預言：若能找到對應某反應過渡態的抗體，將其加入該反應體系中，就可觀測到這個抗體對該反應的催化效應。也即：抗體若能與某化學反應的過渡態結合，則這樣的抗體必也能像酶一樣，使其活化能降低，從而幫助大量反應物分子跨越能障，達到加速反應的目的。這就意味著，抗體一旦能與過渡態相結合，它就具有酶的性質，即在溫和條件下高效專屬地催化學反應。

LinusCarlPauling

尋找過渡態類似物作為半抗原產生的抗體可能具有酶活性

由於ES‡過渡態中間物的半衰期很短，實踐中很難獲得反應的過渡態，若設計和製備穩定的過渡態類似物（能夠模擬一個酶催化反應過渡態的結構的穩定物質，它能與相應的酶緊密結合而成為該酶的競爭性抑制劑），以此替代反應的過渡態作為半抗原，誘導與其互補構像的抗體，這樣產生的抗體就能識別反應過程的真正過渡態，該抗體即有酶催化反應的基本特徵，可能成為一種具有酶活性的抗體。

如願以償

在1986年，加利福尼亞實驗室的Lerner和Schultz同時報導了成功製備具有催化能力的單克隆抗體---催化抗體，證實了抗體和酶一樣，能專一催化化學反應的事實。此後，抗體酶才從理論變為了現實。

目前，抗體酶的研究方向是如何提高酶的效率以及免疫學中的應用。

PeterSchultzAquestion:

抗體酶是酶還是抗體？

二、抗體酶的結構與機制

什麼是酶(enzyme)？酶——活細胞產生，起生物化學反應催化劑作用的蛋白質。

什麼是抗體（antibody，Ab）？抗體——是B細胞識別抗原後增殖分化為漿細胞所產生的一種蛋白質，主要存在於血清等體液中,能與相應抗原特異性地結合，具有免疫功能。

其本質是一類免疫球蛋白。

抗體結構

抗體分子是由兩條輕鏈(lightchain,L鏈)和兩條重鏈(heavychain,H鏈)通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鍵結構。經蛋白酶水解後分為抗原結合片段(antigenbindingfragment,Fab)

和可結晶片段(crystallizabefragement,Fc)；位於H和L鏈的N-端的可變區是抗原的結合位點,由約110個氨基酸構成(variableregion,V)。其中H鏈含4個超變區段，L鏈含3個超變區段，加上兩條鏈的組合，就可產生108以上種抗體分子。

抗體酶模型

抗體酶——Abzyme

是酶的高效催化能力和抗體的高度選擇性巧妙結的產物，本質上是一類具有催化活力的免疫球蛋（Ig），在其可變區賦予了酶的屬性。因此，催化抗體又稱抗體酶。通過一系列化學和生物技術方法製備出具有催化活性的抗體，除了具有相應的免疫學性質，還類似於酶，具有各種催化特性。所以，其實抗體酶是一種特殊的抗體，它有著催化特性，可謂是酶和抗體性質的兼得。所以又被稱為催化抗體。（Catalyticantibody）

抗體酶的作用機制

酶和抗體的本質差別在於：酶是能和反應過渡態

(激發態分子)選擇結合的催化物質。而抗體是和基態分子選擇結合的催化物質,它們識別底物的機理是相同的。如果以激發態的分子為半抗原激發免疫系統產生抗體,那麼這種抗體就可能像酶一樣催化經過此過渡態的化學反應。由於在實踐中很難獲得反應的過渡態，激發態的過渡態分子不可能作為抗原來產生抗體，所以對某一特定的酶催化的化學反應,可以合成一種穩定態分子,它在帶電性能,幾何形狀與反應過渡態分子結構類似。這種穩定態分子即為過渡態類似物。

設計和製備穩定的過渡態類似物，以此代替反應的過渡態作為半抗原誘導產生抗體，這樣產生的抗體就能識別反應過程的真正過渡態，該抗體具有酶催化反應的基本特徵，可能成為一種具有酶活性的抗體。這就是我們所稱的抗體酶。

抗體酶與天然酶相比其優勢何在？（1）抗體酶可以達到專一催化某一底物轉化的反應。（2）抗體酶能催化那些理論上認為非常不利的反應。（3）抗體酶能催化那些天然酶不能催化的反應。

(4)不僅提供了人工生物催化劑，而且提供了研究生物催化過程的新途徑。

抗體的種類非常多，免疫系統可以擁有上億種抗原特異性不同的抗體分子。應用抗體的種類繁多以及抗體酶的可誘導、可改造的特點，有望能製備出具有治療和輔助治療某些疾病和催化某類具有特殊意義反應的抗體酶。

Aquestion:

如何讓抗體具有酶活性？

抗體酶製備的基本原理

按照現代酶學理論，酶首先要和底物結合，使底物向過渡態轉化，然後再在催化基團的作用下促進底物進行反應。免疫反應和酶反應十分相似，抗體也能專一地、高親和力地與抗原物質結合，然後再促使抗原發生各種變化。如果能適當地改變抗體中與抗原結合部位的微環境，並在適當部位引入相應的催化基團，那就有可能使抗體轉變為具有催化性能的抗體酶。三、抗體酶的製備制备方法诱导法基因工程法拷贝法导入法修饰法

誘導法

採用過渡態的底物類似物誘導

(transitionstateanalogue)

作為酶的抑制劑的過渡態類似物是穩定的，因此利用抗體能與抗原特異結合的原理，可用過渡態的類似物作為半抗原來誘發抗體，這樣產生的抗體便能特異的識別反應過程中真正的過渡態分子！

首先設計和製備過渡態的底物類似物，以它作為半

抗原（hapten），再和載體蛋白質一起免疫動物，然後

分出脾細胞，進而和骨髓瘤細胞融合，選出對半抗原有

高亲和力的克隆，使之在培养介质中生长扩增，最后选

择、纯化产生的具有催化活性的单克隆抗体。此法的关

键是要设计和获得适当的过渡态底物类似物作为半抗原。“製備”抗原：設計過渡態類似物合成半抗原半抗原－載體雜交瘤細胞製備：免疫小鼠與骨髓瘤細胞結合限制性稀釋篩選與半抗原具有高親和力的克隆製備單克隆抗體：將細胞培養於腹水液或培養介質中生產單抗純化單抗篩選抗體酶：篩選具有催化性能的單抗

簡言之——

誘導法是選擇適當的化學模型物與載體蛋白連接後給動物免疫，通過雜交瘤技術篩選和分離單克隆抗體（所得抗體催化效果的好壞很大程度上取決於化學模型物的設計）。

基因工程法

對於已經獲得的單抗，分析其氨基酸序列和相應基因的堿基序列，將抗原結合部位的基因換上編碼有催化作用的氨基酸的基因，這就是基因工程法制備抗體酶的主要內容。基因工程的技術使得建立抗體基本的組合文庫，並根據需要構建適當序列的基因片斷已成為可能。利用抗體庫技術，在將來也許有可能繞開免疫，產生完全由基因工程構建的全新抗體酶。

拷貝法

用已知酶作為抗原免疫動物，通過單克隆技術，制得抗該種酶的抗體。再以此種抗體免疫動物，再次採用單克隆技術，經篩選與純化，就可獲得具有原來酶活性的抗體酶(因為抗原與該抗產生的抗體具有互補性，經過上述兩次拷貝，就把酶的活性部位的資訊翻錄到抗體酶上，使該抗體酶能高選擇性地催化原酶所催化的反應)。這種方法對自然界來源稀少的緊缺酶，不失為一種有價值的有潛力的方法。

導入法在現有的抗體基礎上，借助化學修飾或蛋白質工程的辦法將催化基團引入到已有底物結合能力的抗體的抗原結合部位上。可以採用選擇性化學修飾的方法將人工合成的或天然存在的催化基團引入到抗原結合部位；也可採用寡核苷酸定點誘變技術將特定的氨基酸殘基引入抗原結合部位，使其獲得催化功能。化學修飾法

抗體酶和酶一樣也可以用化學修飾的方法加以改造。對抗體酶進行結構修飾的關鍵是找到一種溫和的方法，在抗體結合位置或附近引入具有催化功能的基團。

游離巰基就是適合的基團之一,它具有高親核性,易於氧化,及能通過二硫化物進行交換反應或親電反應而選擇性修飾的特點。Schultz等在IgAMOP315抗體結合部位選擇性的引入了親核性的巰基。其方法如下:用含有易裂解鍵(如二硫鍵或硫鍵)的親和力標記試劑,在NaCNBH3存在下,對抗體進行親和力標記,將標記的抗體通過親和力色譜而純化,然後標記物被裂解形成活潑的二硫化物。大量的催化基團能夠通過二硫化物的交換反應而引入。通過此方法,在IgAMOP315抗體的結合部位引入了巰基(-SH),其催化香豆酯水解的速度比照樣相提高了6×104倍。

四、抗體酶的應用前景

在抗體酶被發現的13年以後，他們才開始進入商業領域。目前已有一些公司，比如：美國的Med-Immune和Prolifaron公司以及以色列的AdvancedBiotechLtd.致力於抗體酶的商業應用，並且取得了一些業績。

（一）、人工設計一些抗體酶來實現對某些手性藥物的立體專一性合成和非酶催化系統的反應的催化。包括催化酯水解、糖苷鍵水解、Diels-Alder反應和Oxy-Cope重排反應等。在催化萘普生乙酯水解的抗體酶研究中，發現所獲得的多克隆和單克隆抗體都能立體專一性地水解R構型的萘普生乙酯，從而開闢了一條抗體酶用於手性合成的道路，此技術已獲授權發明專利。

（二）、有很多世界知名的實驗室提出了許多不同的方案，期望將抗體酶技術應用於醫藥製造方面。其中之一就是利用抗體酶的水解產物來啟動一些藥物前體,通過瞄準腫瘤細胞活性，藥物前體就能直接作用於腫瘤細胞，並且轉化成細胞毒素的化合物。

（三）、一個在醫學方面的應用是利用抗體酶來特異性的水解可卡因。目前美國的哥倫比亞大學正致力於這方面的研究，希望可以找到解決過量吸食毒品的方案。用可卡因磷酸單酯過渡態類似物為抗原製備的抗體酶能催化可卡因中苯甲醯基團的水解，其水解產物芽子堿甲酯和苯甲酸不具有可卡因的刺激作用，這為治療可卡因依賴性的患者提供了可能。

以色列的AdvancedBiotechLtd.正在試圖利用抗體酶技術生產一種藥物來對付革蘭氏陰性膿血症。

所有這些對抗體酶的研究都是為了得到一種具有特定序列的蛋白酶，從而為抗癌療法以及新型疫苗的獲得開闢一條新的道路。1、在診斷肝炎方面的應用

利用抗體酶技術可以方便的診斷出丙型,丁型,戊型肝炎.比如對於戊型肝炎,目前已經研製出一種IgM抗體酶免檢測試劑盒。此試劑盒採用間接ELISA法，檢測戊型肝炎病毒IgG抗體，包被抗原為合成肽(ORF2和ORF3)，酶標抗體為辣根酶標記的抗－μ單抗，試劑全部工作液化，可直接使用，包被板採用可掰板，可單人份檢測，反應過程為50分鐘.

2、在診斷胃腸道惡性腫瘤的應用

根據中華檢驗醫學雜誌(CHINESEJOURNALOFLABORATORYMEDICINE)的介紹，對於結直腸癌的輔助診斷和監測，常用的血清腫瘤生物學標誌為癌胚抗原（CEA）、癌相關糖抗原（CA）19-9、CA72-4及CA242等。根據抗腫瘤單克隆抗體證實，血清腫瘤標誌均為非特異的腫瘤相關抗原［1］，其檢測腫瘤的敏感性及特異性均有限。嘗試將以上與結直腸癌有關的血清腫瘤標誌進行手術前後測定及單項、雙項、3項、4項聯合測定並進行比較，目的在於對各腫瘤標誌在結直腸癌中的應用價值進行評價，並選擇較佳的血清腫瘤標誌組合，以提高檢測結直腸癌的敏感性。

用基因工程人源化的抗體酶代替從細菌中得到對人體有毒副作用的天然酶，把該抗體酶與癌細胞表面抗原特異抗體結合，利用特異抗體，把抗體酶帶到癌細胞的周圍，分解藥物前體，專一殺死癌細胞，大大減少了化療的毒副作用。

3、在診斷愛滋病方面的應用

愛滋病（AIDS）是感染愛滋病病毒（HIV）後免疫功能逐漸喪失的結果。研究證明，除血液標本外，HIV感染者的尿液、唾液、淚液、精液中均可檢測到抗HIV抗體。愛滋病的診斷一直以來以血清學檢查陽性為基礎。最近，一種新的愛滋病診斷試劑———尿液HIV－1抗體酶聯免疫診斷試劑已經進入市場。

尿液HIV－1抗體酶聯免疫診斷試劑與血清學診斷試劑比較，有其獨特的優勢：它不僅和血液HIV抗體酶聯免疫診斷檢測方法一樣，具有較好的可信度，而且尿液中一般不存在HIV病毒，無針頭採集尿液標本，不會引起皮膚損傷，消除了收集血液標本過程中引起的病毒傳播的可能；其次尿液收集簡便易行，便於大規模篩查。由於採樣過程不需要針刺，建立在無損傷收集標本的基礎上，消除了與職業暴露相關的危險因素，可以保護醫護人員和被檢測者避免查體時因針刺意外感染肝炎或愛滋病病毒的危險。因此，該檢測試劑可用於除血源篩查以外人群的愛滋病HIV－1抗體篩查。4、在診斷妊娠反應方面的應用

單克隆抗體酶標絨毛膜促性腺激素檢測法這是目前最先進的妊娠試驗，靈敏度極高,陽性率幾乎百分之百。用本法可在受精後10天左右即在停經之前就能確定診斷，而且操作簡單，人人都能學會，也可以在家庭使用。

小結

取得了很大進展

抗體酶研究已取得很大進展，建立了製備抗體酶的技術（包括免疫法.化學法.基因工程和蛋白質工程等方法），通過這些技術不僅從單克隆抗體中獲得了酶催化活性，而且從多克隆抗體中也獲得了酶催化活性。個別抗體酶的催化反應已接近於天然酶的水準，天然酶催化的六大化學反應，抗體酶都可以進行催化。抗體酶還可以催化天然酶不能催化的反應，在工業及醫學中應用的潛力已初見端倪。

存在的問題

儘管抗體酶的研究已取得很大進展，但還存在一些需要進一步發展的問題，如催化機制的研究。儘管像瑞士的諾華和美國的Bristol-MyerSquibb這樣的跨國公司已經對於抗體酶的研究運用產生了很大的興趣，並且已經與Dr.Lerner領導的研究小組進行了合作，共同開發抗癌藥物。但目前對於抗體酶在工業方面的大部分應用還是處於實驗階段。

綜上所述，催化抗體的出現不僅為人們開創了一條人工設計酶的新方法，也是人們對催化過程中催化劑的作用機理和催化劑與底物的相互識別有了進一步的認識。它無疑會對化學、生物學、醫學等領域產生深遠的影響。當然，抗體酶研究和運用還是剛剛起步，很多實踐和理論上的東西有待解決。

在理論上：對抗體酶的催化效率的預測還剛起步；

在實踐上：還沒有找到一個普遍可行的篩選法；

在應用上：沒有找到真正運用的抗體酶；

最重要的一點是：抗體酶與天然酶相比，抗體酶的催化效率和轉換數遠遠低於天然酶，還不能成為真正意義上的酶。但隨著抗體酶研究的深入，特別是抗體酶製備技術的成熟以及抗體酶結晶學研究的不斷深入，科學家有希望達到有目的地改造和構建抗體酶，使之成為真正意義上的酶！

酶分子修飾與模擬

酶作為生物催化劑，其高效性和專一性是其他催化劑所無法比擬的。因此，日益增多的酶製劑已用於食品發酵、疾病診治和預防、環境保護和監測、化工產品的生產，以及基因工程等生物技術領域。但是酶在實際應用中有局限性：1、作為異體蛋白在體內難於吸收、易引起免疫反應和被識別降解；2、酶蛋白經不起溫度、酸堿、有機溶劑及時間的考驗，

半衰期短、易變性失活；3、酶的活性、作用專一性和最適條件不一定能適應生產工藝要求，限制了酶製劑的應用範圍。

對策——

酶分子工程

（MOLECULARENGINEERINGOFTHEENZYME）

分子酶工程可以從分子水準改造酶，彌補天然酶的缺陷，並賦予它們某些新的機能和優良特性。隨著各學科及相關技術的發展，特別是對酶結構與功能的深入瞭解、基因工程及固定化技術的普及，使酶分子工程已進入實用階段。總體來說酶的分子工程分兩部分：一是分子生物學水準，即用基因工程方法對DNA或RNA進行分子改造，以獲得化學結構更理想的酶蛋白；二是對天然酶分子進行改造（包括酶一級結構中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側鏈修飾等)。

酶分子工程主要有以下幾方面的內容1）化學修飾（一級結構改造）：對酶分子的側鏈基團、酶活性中心中的必需基團進行化學修飾，改造酶性能、研究酶結構與功能的關係；2）變性、誘導與構象重建（高級結構調整）3）蛋白質工程（基因水準定位突變）：用分子生物學方法克隆酶或修飾基因以便產生新的酶（如突變酶），或設計新基因合成自然界不存在的新酶（如抗體酶）4）固定化酶：通過對酶分之內或分之間的交聯，或與水不容性載體的結合製成，催化特定的反應。5）模擬酶：用化學方法合成新的有機催化劑，使其具有酶活性。

一、酶的化學修飾（一級結構水準的改造）

（原理、方法、应用）

化學修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修飾條件，在保持酶活性的基礎上，能夠在較大範圍內改變酶的性質，創造天然酶所不具備的優良特性，甚至創造出新的活性。

化學修飾方法雖多，但基本都是利用修飾劑所具有的各種化學基團特性，或直接或经过一定的活化过程，與酶分子上某氨基酸殘基（一般儘量選酶活性非必需基團）產生化學反應，對酶分子結構進行改造。1、化學修飾原理

凡通過化學基團的引入或除去而使酶蛋白共價結構發生改變（側鏈基團的取代、肽鏈的限制性水解、分子內或分子間的交聯），都可稱為蛋白質的化學修飾。達到：改造酶的作用特性（包括改變酶活性、專一性、對效應物回應性能及對輔助因數的要求）提高酶的穩定性擴大在體內應用可能性（防止在體內非專一性水解、減少和消除免疫原性以利於醫療應用）

用纖維蛋白的專一性單克隆抗體修飾尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍

用乙醛酸修飾胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成親水性的α－NHCH2COOH後，該酶對60°C熱處理的穩定性增高了1000倍。

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、L－穀氨醯胺酶、L－門冬醯胺酶、尿酸酶等用PEG修飾後，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，減慢了它們在動物血液迴圈中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％。2、化學修飾方法的幾個問題

決定化學修飾成敗的關鍵是修飾的專一性，儘量少破壞必需基團，得到高的酶活力回收。為此，有時需要通過反復試驗來確定。其中：對酶性質的瞭解：活性部位、穩定條件、反應最佳條件及側鏈基團性質等；選擇修飾劑考慮：1）分子量、修飾劑鏈長和對蛋白吸附性；2）修飾劑上反應基團的數目及位置；3）修飾劑上反應基團的活化方法和條件（一般要求較大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有較多反應活性基團）；選擇酶反應條件要注意：1）反應體系的溶劑性質、鹽濃度、PH、溫度、時間；2）酶與修飾劑的比例。參考：酶工程P.86(1)、試劑的選擇—要根據修飾目的選擇

例如對氨基修飾可有幾種情況——修飾所有氨基而不修飾其他基團；僅修飾

-氨基；修飾暴露的或反應性高的氨基；修飾具有催化活性的氨基；例：如果修飾目的是希望改變蛋白質的帶電狀態或溶解性，則必須選擇能引入最大電荷量的試劑。。。。（酶工程P86）用於修飾酶活性部位氨基酸殘基的試劑應具備：選擇性地與一個氨基酸殘基反應；反應在酶蛋白不變性條件下進行；所標記的殘基在肽鏈中穩定以易於分離鑒定；修飾反應的程度能簡單測定；最常用的修飾劑——PEG類修飾劑

聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)通常沒有免疫原性和毒性,不會破壞生物分子的活性，其生物相容性已通過美國食品和藥物管理局(FDA)認證。特別是當酶經過PEG類修飾劑修飾後，修飾劑的許多優良性質也會在修飾蛋白中得到體現。PEG分子末端有兩個能被活化的-OH基團，化學修飾時則多採用甲氧基聚乙二醇(MPEG)的衍生物為修飾劑。PEG分子量範圍很寬，適合用作修飾劑或修飾劑出發原料的PEG的相對分子品質一般為500～20000。

PEG既溶於水，又溶於絕大多數有機溶劑，但不溶於乙醚、脂肪烴。(2)、反應條件的選擇不造成蛋白質的不可逆變性（通過對照實驗）；有利於專一性修飾（小心控制條件，盡可能在酶蛋白特定構象不變或少變的情況下進行）；溫度、PH、反應介質和緩沖液；修飾劑專一性；

在所有影響化學修飾的反應條件中,PH值是最重要的一個條件,因為它決定了具有潛在反應能力的功能基團所處的可反應和不可反應的解離狀態。一般情況下,增加PH可以提高反應速率,降低PH可以減小反應速率。反應活性較高的修飾劑可以在生理PH下與蛋白質耦合;而反應活性較低的修飾劑通常需要較高的PH。修飾反應的專一性則對應有一個優化PH值。(3)、反應的專一性

除考慮修飾試劑專一性、控制反應條件外，還可利用其他途徑來實現修飾專一性：

利用酶蛋白質分子中某些基團的特殊性（如蛋白酶的絲氨酸與DFP）；選擇不同的PH以控制相關功能基團的解離狀態，從而有利於專一修飾（如鹵代乙酸對半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸等的作用）；

親和標記試劑（如甲基苯磺醯氟作用於胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸上）；

差示標記（在底物或抑制劑存在下進行化學修飾）；

利用蛋白質狀態的差異（如在結晶狀態下反應）；

利用某些產物的不穩定性；

使用非特異試劑對特殊基團的標記；

非特異性試劑：不能區分活性部位內和活性部位外基團的試劑。

特殊基團:某些酶的活性部位含有活性部位以外沒有的氨基酸殘基，如（-HS基）。例如：木瓜蛋白酶中有7個半胱氨酸殘基，其中的6個形成三對二硫橋，只有一個殘基以自由巰基形式存在於活性部位，這時就可以用任何一種巰基試劑來標記（如碘乙酸）得到巰基修飾與活力喪失相平行的結果。若是非特殊基團，要充分利用活性部位中某一基團具有特別高的反應性的有利條件進行化學修飾。（如胰凝乳蛋白酶的Ser-195與DFP的作用）+x-y

親和標記主要利用酶和底物特異結合的性質設計標記試劑。

差示標記是非特異性試劑標記的一個發展，要求被標記的活性部位基團有特殊靈敏的反應性。+RRR(a)+PP+RRP-PR+R*RR*(b)（4）、酶蛋白側鏈基團的常用修飾水溶性的碳二亞胺類特定修飾酶的羧基；賴氨酸氨基的烷基化（鹵代乙酸等）；具有兩個臨位羰基的化合物修飾精氨酸胍基（丁二酮等）；烷基化試劑修飾巰基；碘代乙酸修飾組氨酸咪唑基；還有色氨酸吲哆基、甲硫氨酸甲硫基、酚基、脂肪族羥基等；二硫鍵的化學修飾氨基的化學修飾羧基的化學修飾

應用比較多的修飾方法1.酶的表面化學修飾

(1).大分子修飾：可溶性大分子，其中相對分子量在500-20000u範圍內的PEG（聚乙二醇）類修飾劑應用最廣，既能溶於水，又可以溶於大多數的有機溶劑，它一般沒有免疫原性和毒性。化學修飾時多採用單甲氧基聚乙二醇（MPEG)(2).小分子修飾：利用小分子化合物對酶的活性部位或活性部位之外的側鏈基團進行化學修飾，以改變酶學性質。已經被廣泛應用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖，乙酸酐，硬脂酸，鄰苯二酸酐等。(3).交聯修飾：使用雙功能基團試劑如戊二醛，PEG等將酶蛋白分子之間，亞基之間或分子內不同肽鏈部分間進行共價交聯，可使酶分子活性結構加固，並可提高其穩定性，增加了酶在非水溶液中的使用價值。(4).固定化修飾：通過酶表面的酸性或鹼性殘基，將酶共價連接到惰性載體上後，由於酶所處的微環境的改變，會使酶的性質（最適ph，最適溫度，穩定性等）改變。2.酶分子內部修飾(1).非催化活性基團的修飾(2).蛋白主鏈的修飾(3).催化活性基團的修飾(4).與輔因數相關的修飾

3.結合定點突變的化學修飾

通過一些可控制的方法在酶的關鍵活性位點引入一個氨基酸殘基，然後利用化學修飾法將突變的氨基酸殘基進行修飾，引入一個小分子化合物，得到一種稱為化學修飾突變酶（CMM)的新型酶。3、酶化學修飾的應用

酶經過化學修飾後會產生的變化：1.提高生物活性；2.增強在不良環境中的穩定性；3.針對特異性反應降低生物識別能力，解除免疫原性；4.產生新的催化能力；

在醫藥方面：化學修飾可以提高醫用酶的穩定性，延長它在體內半衰期，抑制免疫球蛋白的產生，降低免疫原性和抗原性。

在生物技術領域：化學修飾酶能夠提高酶對熱，酸，堿和有機溶劑的耐性，改變酶的底物專一性和最適ph等酶學性質。

在酶結構功能研究中：1.研究酶空間結構與功能的關係，如酶的活性中心研究；2.確定氨基酸殘基的功能；3.測定酶分子中某種氨基酸的數量。4、酶蛋白化學修飾的局限性1.某種修飾劑對某一氨基酸側鏈的化學修飾專一性是相對的，很少有對某一氨基酸側鏈絕對專一的化學修飾劑。2.化學修飾後酶的構象或多或少都有一些改變，因此這種構象的變化將妨礙對修飾結果的解釋。3.酶的化學修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側鏈上進行，目前還不能用化學修飾的方法研究非極性氨基酸殘基在酶結構與功能關係中的作用。4.酶化學修飾的結果對於研究酶結構與功能的關係能提供一些資訊，如某一氨基酸殘基被修飾後，酶活力完全喪失，說明該殘基是酶活性所“必需”的，為什麼是必需的，還得用X射線和其他方法來確定。因此化學修飾法研究酶結構與功能關係尚缺乏準確性和系統性。（二）、變性、誘導與構象重建

（对酶高级结构调整）

酶肽鏈變性鬆散後，使其在有底物類似物或抑制劑存在的非天然條件下複性，酶將折疊成所需要的特殊結構，產生新的性狀，此即變性誘導構象重建的原理

實驗證據：在8mol/L尿素存在下，用巰基乙醇處理天然RNase,其二硫鍵全部斷裂，肽鏈鬆散，活性全部喪失，但當用透析法除去尿素、巰基乙醇後，RNase活力全部恢復，而且復原後產物其物化性質與天然RNase完全相同；然而在隨機情況下，8個HS—形成4個—S—S時，應有105種不同方式，但在復原過程中，走向隨機的RNase肽鏈卻只選擇了其中一種方式（即與天然構象完全相同）.

（三）、蛋白質工程

（基因水平上进行蛋白质改造）以重組DNA技術為基礎，結合X-衍射分析技術、蛋白質溶液構象理論及電腦輔助設計發展起來的一種定點定位修飾技術體系，也是在基因水準進行蛋白質改造的技術科學。常用：化學全合成法、限制酶酶切片斷取代法等。蛋白質工程在酶的改造方面目前研究比較系統的例子是組織型血纖維蛋白溶酶原啟動劑（TpA）P81蛋白質工程的主要方法化學全合成法限制性內切核酸酶酶切片段取代法寡核苷酸引物指導的定點突變

二、酶的模擬

早在20世紀中葉，人們就已認識到研究和模擬生物體系是開闢新技術的途徑之一，並自覺地把生物界作為各種技術思想、設計原理和發明創造的源泉，通過對生物體系結構與功能的研究，為設計和建造新的技術提供新思想、新原理、新方法和新途徑。酶是自然界經過長期進化而產生的生物催化劑，對酶這樣的高效催化劑的結構功能的設計和模擬，是當今自然科學領域中的前沿課題之一。模擬酶的基本概念

模擬酶又稱人工酶或酶模型，它是有機化學的一個分支。由於天然酶的種類繁多，模擬的途徑、方法、原理和目的不同，對模擬酶至今沒有一個公認的定義。一般認為，所謂模擬酶就是利用有機化學的方法合成一些比酶簡單的非蛋白質分子，它們可以模擬酶對底物的絡合和催化過程，既可達到酶催化的高效性，又可以克服酶的不穩定性。對酶的模擬已不僅局限於化學手段，化學和分子生物學方法的結合使酶模擬更加成熟起來。模擬酶的分類單純酶模型：以化學方法通過天然酶活性的模擬來重建酶活性；機理酶模型：通過對酶作用機制如識別、結合和過渡態穩定化的認識，來指導模型酶的設計和合成；單純合成的酶樣化合物：化學合成具有酶樣催化劑活性的簡單分子；目前，較為理想的小分子仿酶體系有環糊精、冠酶、環番、環芳烴和卟啉等大環化合物；大反子仿酶體系有聚合物酶模型，分子印跡酶模型和膠囊酶模型等。固定化酶

（ImmobilizedEnzyme）

酶在水溶液中不穩定，一般不能反復使用，而且不易與產物分離，不利於產物的提純和精製。針對這些限制酶廣泛應用的因素，將水溶性酶或游離細胞經過化學或物理手段處理，將酶束縛在一定的空間內，限制酶分子在此區間進行活躍的催化作用，成為不溶於水的固定化的酶或細胞。

固定化酶的製備方法、性質、固定化酶反應器和應用

1953年，Grubhofev和Schleith首先開始了酶固定化研究，並第一次實現了酶的固定化。

1960年，日本的千畑一郎開始了氨基醯化酶固定化研究，開始了將固定酶應用在工業上的第一步。

1969年，千畑一郎成功地將氨基醯化酶反應用於DL-AA的光學分析，實現了酶連續反應的工業化。這是世界上固定化酶用於工業的開端。

1973年，千畑一郎再次在工業上成功地固定化大腸桿菌細胞，成功實現了L-天冬氨酸連續生產。

吸附法包埋法共價結合法共價交聯法一、固定化酶(細胞)的製備方法(一)、吸附法吸附法是通過載體表面和酶分子表面間的

次級鍵相互作用而達到固定目的的方法。只需將酶液與具有活潑表面的吸附劑接觸，再經洗滌除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最簡單的固定化技術，在經濟上也最具有吸引力.

根據吸附劑的特點又分為兩種：物理吸附法(physicaladsorption)是通過氫鍵、疏水鍵等作用力將酶吸附於不溶性載體的方法。常用的載體有：高嶺土、皂土、矽膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微空玻璃等無機吸附劑，纖維素、膠原以及火棉膠等有機吸附劑。離子結合法(ionbinding)是指在適宜的pH和離子強度條件下，利用酶的側鏈解離基團和離子交換基間的相互作用而達到酶固定化的方法（離子鍵）。最常用的交換劑有CM-纖維素、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等；其他離子交換劑還有各種合成的樹脂如AmberliteXE-97、DoweX-50等。離子交換劑的吸附容量一般大於物理吸附劑。

影響酶蛋白在載體上吸附程度的因素:1.PH：影響載體和酶的電荷變化,從而影響酶吸附。2.離子強度：多方面的影響，一般認為鹽阻止吸附。3.蛋白質濃度：若吸附劑的量固定，隨蛋白質濃度增加，吸附量也增加，直至飽和。4.溫度：蛋白質往往是隨溫度上升而減少吸附。5.吸附速度：蛋白質在固體載體上的吸附速度要比小分子慢得多。6.載體：對於非多孔性載體，則顆粒越小吸附力越強。多孔性載體，要考慮吸附對象的大小和總吸附面積的大小。

吸附法的優點：操作簡單，可供選擇的載體類型多，吸附過程可同時達到純化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活後可以重新活化和再生。

吸附法的缺点：酶和載體的結合力不強，會導致催化活力的喪失和沾汙反應產物；經驗性強。

世界第一例获得工业应用的固定化酶是

DEAE-SephadexA-25吸附的氨基醯化酶反應用於

DL-AA的光學分析。（二）、包埋法

包埋法是將酶物理包埋在高聚物網格內的固定化方法。(如將聚合物的單體和酶溶液混合後，再借助聚合促進劑的作用進行聚合，將酶包埋於聚合物中以達到固定化的目的）。

1、凝膠包埋法：

将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。

聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法：

先把丙烯醯胺單體、交聯劑和懸浮在緩衝溶液中的酶混合，然後加入聚合催化系統使之開始聚合，結果就在酶分子周圍形成交聯的高聚物網路。它的機械強度高，並可以改進酶脫落的情況，在包埋的同時使酶共價偶聯到高聚物上，可以減少酶的脫落。

海藻酸鈉也可以用來作為包埋載體，它從海藻中提取出來，可被多價離子Ca2+、Al3+凝膠化，操作簡單經濟。

K-角叉萊膠（卡拉膠）冷卻成膠或與二、三價金屬離子成膠。包埋條件溫和無毒性，機械強度好。固定化的酶活回收率和穩定性都比聚丙烯醯胺法好。

膠原和明膠也是常用的包埋載體。2、微囊化包埋法微囊法主要將酶封裝在膠囊、脂質體和中空纖維中。膠囊和脂質體主要用於醫學治療，中空纖維主要適於工業使用。介面沉澱法是一種簡單的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有機相的介面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。介面聚合法是用化學手段製備微囊的方法。他所得的微囊外觀好，但不穩定，有些酶還會因在包埋過程中發生化學反應而失活。

包埋法的優點在於它是一種反應條件溫和、很少改變酶結構但是又較牢固的固定化方法。

包埋法的缺點是只有小分子底物和產物可以通過高聚物網架擴散，對那些底物和產物是大分子的酶並不適合。這是由於高聚物網架會對大分子物質產生擴散阻力導致固定化酶動力學行為改變，使活力降低。

（三）、共價偶聯法

是目前研究中最為活躍的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基團和固相支持物表面上的反應基團之間形成共價鍵，因而將酶固定在支持物上（借助共價鍵將酶的非活性必需側鏈基團和載體的功能基團進行偶連）。

共價偶聯法中的幾個影響因素

1、載體的物化性質要求載體親水，並且有一定的機械強度和穩定性，同時具備在溫和條件下與酶結合的功能基團。

2.偶聯反應的反應條件必須在溫和PH、中等離子強度和低溫的緩衝溶液中。

3.所選擇的偶聯反應要儘量考慮到對酶的其他功能基團副反應盡可能少。

4.要考慮到酶固定化後的構型，儘量減少載體的空間位阻對酶活力的影響。

共價偶聯法的優點：得到的固定化酶結合牢固、穩定性好、利於連續使用，是目前應用和報導得最多的一類方法。

共價偶聯法的缺點也很明顯。載體活化的操作複雜，反應條件激烈，需要嚴格控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。同時共價結合會影響到酶的空間構象，從而對酶的催化活性產生影響。

（四）、交聯法

共價交聯法的基本原理是酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵得到三向的交聯網狀結構交聯法是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進行膠聯反應，把酶蛋白分子彼此交叉連接起來，形成網路結構的固定化酶。能起交聯作用的試劑很多，但目前常用的交聯試劑是戊二醛和雙耦聯苯胺-2,2’-二磺酸。交聯法常與吸附法結合使用，或者與包埋法配合，目的是使酶緊緊地結合於載體上。

共價交聯法的四種形式：酶直接交聯法：

在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴於酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強度、溫度和反應時間之間的平衡。操作簡單，但是缺乏選擇性，活力回收往往不高。酶輔助蛋白交聯：

當可得到的酶量有限，可以使用第二個“載體”蛋白來增加蛋白質濃度，從而使酶與惰性蛋白共交聯的方法。這種“載體”蛋白即輔助蛋白，可以是白蛋白、明膠、血紅蛋白等。吸附交聯法：

此法先將酶吸附在矽膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯，用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。載體交聯法：

用多功能試劑的一部分功能基團化學修飾高聚物載體，而其中的另一部分功能基團偶聯酶蛋白。

四種固定化酶製備方法的特點小結物理吸附包埋法共價交聯法共價結合法製備易易難難結合力弱強強強酶活力高高中中底物專一性無變化無變化有變化有變化再生可能不可能不可能不可能固定化費用低中中高制法特性1.必須注意維持酶的催化活性和專一性2.酶與載體結合牢固3.載體的機械強度4.固定化酶要有最小的空間位阻5.載體穩定，不可與底物、產物發生反應6.固定化酶要廉價固定化方法與載體的選擇

固定化細胞

固定化細胞是指直接將細胞固定在水不溶性載體上，在一定的空間範圍內進行生命活動（生長、繁殖和新陳代謝）的細胞。

固定化細胞的優點：

1、可增殖，細胞密度大，可獲得高度密集而體積小的生產菌集合體。

2、發酵穩定性好，可以較長時間反復使用或連續使用。

3、發酵液中含菌體較少，有利於產品分離純化。

4、有利於需要輔酶和多酶系統才能進行的反應。

固定化酶(細胞）應用實例固定化酶和固定化細胞應用生產時間氨基醯基轉移酶DL-氨基酸的旋光度解析1969葡萄糖異構酶將葡萄糖異構變為果糖1973青黴素醯胺酶生產6-APA1973天冬氨酸酶生產L-天冬氨酸1973延胡索酸酶生產L-蘋果酸1974ß-半乳糖苷酶水解乳糖1977L-天冬氨酸ß-脫羧酶生產L-丙氨酸1982

二、固定化酶（細胞）的性質

有一定的機械強度且穩定性好，催化劑與系統分相。固定化酶在使用前可充分洗滌，不帶進雜質，在反應中酶與產物自然分開，所以產物易提純，收率也高。酶與細胞經過固定化以後，穩定性大為提高，可較長期使用與儲藏，並可以再生。

能反復使用，可大大降低生產成本；同時也為實現生產的管道化、連續化與自動化提供了可能。（一）、影響固定化酶（細胞）性質的因素

酶經過固定化後引起的性質改變，不外乎兩種原因：一是酶本身的變化，二是受固定化載體的物理或化學性質的影響。就載體物化性質和固定化過程影響而言，主要存在以下三種影響效應：

分配效應

空間障礙效應

擴散限制效應

1、分配效應由於載體和底物的性質差異引起了微環境和宏觀環境之間的性質不同。微環境是在固定化酶附近的局部環境，而將主體溶液稱為宏觀環境。由這種不同造成的底物、產物和各種效應物在兩個環境之間的不同分配，被稱為分配效應。

2、空間障礙效應固定化之後，由於酶的空間自由度受到限制(因為載體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當，給酶的活性部位造成了空間屏障)，使酶分子的活性基團不易於底物或效應物接觸，影響酶分子的分子活性中心對底物的定位作用,所造成的對固定化酶的活力的影響效應，被稱為空間障礙效應。

3、擴散限制效應酶固定化使生物催化反應從均相轉化為多相，於是產生了擴散阻力：

1）、外擴散阻力是底物從宏觀環境向酶顆粒表面傳遞過程中的一種擴散限制效應，它發生在反應之前，發生在固定化顆粒周圍的液膜層。它會使底物在固相酶周圍形成濃度梯度，通過增加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外擴散效應。

2）、內擴散阻力是指底物分子達到固相酶表面後傳遞到酶活性部位時的一種擴散阻力，它與催化反應同時進行。載體小而彎曲的細孔是產生內擴散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒徑、載體孔盡可能大而直且互相連通，或僅僅將酶固定在載體表面都可以降低這種內擴散阻力。

（二）、固定化酶（細胞）性質的改變1、固定化酶的活力在大多數情況下比天然酶下降，其專一性也會受到影響發生改變。

活力下降的原因：

酶分子在固定化過程中，酶的空間構像發生了變化，甚至活性中心的氨基酸也會參加反應。

固定化後的空間障礙效應的影響。

內擴散阻力的影響使底物分子與活性中心的接近受阻。

包埋法時被高分子物質半透膜包圍。

2、固定化後酶穩定性提高

穩定性提高的原因：

固定化後的酶與載體多點連接，可防止酶分子伸展變形。

酶活力的緩慢釋放。反應開始只有部分酶起作用，其餘部分僅在開始起作用的酶變性後才起作用。

抑制自降解，提高了酶穩定性。

3、固定化酶（細胞）的作用pH變化

酶固定化後，對底物的最適PH曲線常常發生偏移。一般來說，帶負電荷載體製備的固定化酶，其最適PH值較游離酶偏高，反之，若使用帶正電荷載體的話，其最適PH值較游離酶偏低，即向酸性偏移。

為什麼？（從分配效應說明）

4、固定化酶（細胞）的最適溫度的變化

酶反應的最適溫度是酶熱穩定性與反應速度的綜合結果。因為固定化後，酶的熱穩定性提高，所以最適溫度也隨之提高，這是很有利的結果。

5、米氏常數Km的變化

固定化酶的表觀米氏常數Km隨載體的帶電性能變化。簡單說，由於高級結構變化及載體影響引起酶與底物親和力變化，從而使Km變化。而這種Km變化又受到溶液中離子強度影響：離子強度升高，載體周圍的靜電梯度逐漸減小，Km變化也逐漸縮小以至消失。

（三）、固定化酶（細胞）的活力

固定化酶的活力即是固定化酶催化某一特定化學反應的能力。其大小可以用在一定條件下它所催化的某一反應的反應初速度來表示。

它的單位可定義為每毫克幹重固定化酶每分鐘轉化底物的量：用μmol/min·mg或μmol·min-1/cm2

1）、活力測定方法分為：

間歇測定：在攪拌或振盪反應器中，在與溶液酶同樣測定條件下進行，然後間隔一定時間取樣，過濾後按常規進行測定。連續測定：固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過底物，測定酶柱流出液，根據流速和反應速度之間關係，算出酶活力。

活力回收=×100%3）、固定化酶（細胞）的半衰期在連續測定條件下，固定化酶的活力下降為最初活力一半所經歷的連續工作時間稱為固定化酶的半衰期。以t1/2表示。固定化酶的操作穩定性是影響使用的關鍵因素，半衰期是衡量穩定性的指標。

2）、固定化酶的活力回收

固定化酶（細胞）熱穩定性變化固定化酶（細胞）對有機試劑（乙醇）穩定性變化下一幅固定化酶（細胞）對酶抑制劑（尿素）的穩定性變化下一幅固定化酶（細胞）對PH穩定性變化

三、固定化酶反應器

批量式攪拌桶式反應器

BatchStirredtankreactor,BSTR

結構簡單，不需要特殊設備，適於小規模實驗。當前食品和飲料工業有採用這種形式反應器。一般應用溶液酶或粗酶製劑催化，酶不回收，待反應轉化至一定程度後，通過加熱或其他方法直接使之失效除去。但在反復過濾或離心回收過程中，易造成酶的失效損失。工業上很少用.

連續流攪拌桶式反應器ContinuousStirredtankreactor,CSTR

催化劑採用顆粒狀的固定化酶，少數應用片狀固定化酶。運轉過程中要不斷分出部分反應液，同時補充等量的新鮮底物溶液，為不致使酶隨反應液流失，所以在它的出口處通常有濾膜。利於有底物抑制場合.

連續攪拌桶式超濾反應器CSTR/Ultrfitrationreactor,CSTR/UFR

由連續流攪拌桶式反應器和超濾裝置組合而成，為小分子量產物與高分子底物的分離、底物較徹底的轉化以及溶液酶或固定化酶的反復使用提供了可能。但酶易因循環超濾而失效損失。

填充式反應器PlugFlowreactor,PFR

床內用顆粒狀或片狀固定化酶填充，運轉時，底物按一定方向以恒定速度通過反應床。使用最普遍.

流動床反應器

Fluidizedbedreactor,FBR

底物溶液以足夠大的流速向上通過固定化酶床層，使固體顆粒處於流化狀態。混合程度高，故傳熱、傳質情況良好。可用於處理粘性強和含有固體顆粒的底物，或用於需要供應氣體或排放氣體的反應。

迴圈流式反應器

Recyclereactor,RCR

把部分流出物與加料流混合，然後再令其進入反應器。特點是可以提高液體的流速和減少底物向固定化酶表面傳遞的阻力。

固定化酶反應器的選擇依據固定化酶的形狀底物的物理性質酶反應動力學特性酶的穩定性操作要求及反應器費用

1、固定化酶的形狀一般言之，顆粒狀或片狀固定化酶對連續流攪拌桶式反應器和填充式反應器類型的反應器均可適用。但膜狀和纖維狀的固定化酶則不適於連續流攪拌桶式反應器，而適用於填充式反應器。另一方面，如果固定化酶易變形、易粘結或顆粒細小時，那麼在填充於填充式反應器後，往往會引起高的壓力降和堵塞床層，並且在大規模生產中無法實現高的流率。此時宜採用流動床反應器。

2、底物的物理性質底物分三種情況：溶解性物質、顆粒物質與膠狀物質。溶解性底物顯然對任何類型反應器均不會造成困難。顆粒狀和膠狀底物則往往會導致床層堵塞，對此可用迴圈反應器或流動床反應器。連續流攪拌桶式反應器只要攪拌速度足夠高，能維持底物和固定化酶良好的懸浮狀態，也可用於顆粒狀底物。但高的攪拌速度會導致固定化酶從載體上被剪切下來，所以轉速不能太高。3、酶反應動力學特性

一般而言，填充床反應器在固定化酶反應器中佔有主導地位，它適合於產物抑制的場合；但在底物抑制的系統中，則連續流攪拌桶式反應器的性能又優於填充床。流動床反應器因其流動特性接近連續流攪拌桶式反應器，故也適宜於底物抑制的反應。

4、酶的穩定性在反應器操作過程中，由於攪拌漿或液流的剪切作用，常會使固定的酶從載體上脫落下來，或由於磨損，引起粒度的減小而影響固定化酶的操作穩定性，其中尤以連續流攪拌桶式反應器最為嚴重。為解決這一問題而改進反應器設計，是把酶直接粘接在攪拌軸上，或把固定酶設置在與軸相連的金屬網籃內。5、操作要求及反應器費用

連續流攪拌桶式反應器是最便宜的，它結構簡單，且具有良好的操作性，適應性強；而其他類型的反應器，則都需為特定的生產過程專門設計和製造。在討論反應器價格的同時，還應該考慮固定化酶本身的費用，及在各種反應器中的穩定性。四、固定化酶的應用固定化酶在工農業生產上的應用固定化酶在醫藥治療上的應用固定化酶在分析化學中的應用固定化酶與基礎理論

固定化酶在工農業生產上的應用

產物

酶或細胞

固定化方法

原料L-氨基酸果糖漿6APAL-門冬氨酸L-蘋果酸低乳糖牛奶乳糖幹蛋白果汁脫苦啤酒植物白脫脂肪酸氨基醯化酶葡萄糖異構酶或含該酶之菌體青黴素醯胺酶含有門冬氨酸的菌體含有反丁烯二酸酶的菌體乳糖酶鹼性蛋白酶葡萄糖氧化酶和氧化氫酶柚苷酶木瓜蛋白酶脂肪酶脂肪酶載體結合法載體結合法或交聯法載體結合法膠格包埋法膠格包埋法載體結合法載體結合法膠格包埋法載體結合法載體結合法或包埋法膠格包埋法載體結合法乙醯-DL-氨基酸葡萄糖青黴素G反丁烯二酸反丁烯二酸牛奶牛奶蛋白桔類果汁生啤酒植物油植物油

產物

酶或細胞

固定化方法

原料類固醇L-丙氨酸D-苯甘氨酸ATP核苷酸類味精乙醇啤酒L-亮氨酸乙酸乳酸澱粉酶桿菌肽氫氣含脫氫酶及羥化酶的菌體含有L-門冬氨酸、β-脫羧酶的菌體氨基醯化酶乙醯激酶5’-磷酸二酯酶，5’-腺苷酸脫氨酶Sacharomycescarlsbergensie或S.Cerevisiae同上SerratiamarcescensAectobcter.sp.乳酸桿菌與酵母BacillussubstilisBacillsp.ClostridiumbutyicumRhodospirilliumrubrum膠格包埋法包埋法載體結合法載體結合法載體結合法角叉膠或聚丙烯醯胺膠包埋聚乙烯氯或多孔磚吸附或海藻酸包埋角叉膠包埋水合氧化鈦吸附明膠包埋聚丙烯醯胺膠包埋聚丙烯醯胺膠包埋聚丙烯醯胺或瓊脂包埋類固醇前體L-門冬氨酸乙醯-DL-苯基苷氨酸ADPRNA葡萄糖培養基蘇氨酸培養基乙醇培養基

固定化生長菌體在三廢處理上的應用應用內容

菌體

固定化方法

毒物廢水處理脫氮作用CandidatropicalisPsendomonasPutida各種微生物混合培養PseadomonasspMicrococcusderitrificans聚丙烯醯胺膠包埋聚丙烯醯胺膠包埋皂土和Mg＋＋或聚氨基甲酸乙酯海綿活性炭吸附液膜酚苯廢水亞硝酸、硝酸

固定化酶在醫藥治療上的應用

溶液酶的應用缺陷：酶作為異體物質，在體內應用會導致免疫反應酶是蛋白質，在體內易被網狀內皮系統移除和被蛋白質酶水解破壞由於稀釋效應，藥物酶無法集中於靶器官組織以達到治療所需的最適高濃度

1、轉入體內發揮作用（口服和注入）

口服：最初主要限於消化酶類，近年來也有人嘗試將酶以口服方式用於尿中毒等疾患的治療。口服的優點是藥物通過粘膜吸收後能迅速進行擴散，進入體內，通常不會引起免疫反應。注入：是最有實用價值的一種方式，溶液酶的弱點集中於此方式。固定化酶可很好的地解決這一問題，辦法是將藥物酶包埋於半透膜中，可容許小分子底物自由出入包埋膜，而藥物酶和破壞它的蛋白水解酶以及其他免疫因數等不會直接接觸，因而可延長酶在體內的半壽期和避免免疫過敏反應。如果選擇載體適宜，或者在載體上偶聯適當成分，還可使藥物酶比較集中的送到靶細胞。

2、通過“體外迴圈”做成人工臟器

固定化酶也可做成“人工臟器”參與體外迴圈，應用有兩方面：用於除去有害的毒性物質及有潛在毒害作用的代謝產物除去氨基酸，使需要這些物質的病變組織“餓死”；治療時只需將患者的血液引出體外，通過由固定化酶等構成的“人工臟器”加以處理，然後再回流體內。

酶應用方式

載體應用對象半壽期

優缺點尿酸酶門冬醯胺酶脲酶脂肪酶酪氨酸酶穀氨醯胺酶β-葡糖苷酸酶β-葡糖苷酸酶膽紅素葡糖醛酸基轉移酶過氧化氫酶組成體外迴圈移接體內迴圈口服體內迴圈體內迴圈體內迴圈體內迴圈體內迴圈體內迴圈血液透析裝置Dacron脈管修複用和移接管尼龍微囊腸衣包被可溶性的聚順丁烯二酸與聚丙烯酸聚合物可溶性的聚乙二醇血影細胞脂質體和聚乙烯吡咯烷酮結合的微粒體尼龍微囊急淋白血病尿胰機能不全癌瘤癌瘤取代和補償先天缺失補償先天缺失黃疸約2d1d1d24h24h18h短暫優點：加速尿酸移去缺點：需移去尿素優點：無免疫原性質優點：易缺點：消亡快；載體有毒優點：抗酸優點：最適pH向中性偏優點：無抗原性半壽期長優點：抗原性優點：載體能被代謝缺點：對載體內含物敏感優點：不需分離酶缺點：需輔助因數擴散優點：能做成糊狀缺點：在唾液很快移除

包埋藥用酶的載體可溶性載體聚乙烯吡咯酮烷多糖或糖肽聚乙二醇聚氨基酸以及血清白蛋白其他（核酸和脂類物質等）不可溶性載體半透性聚合酶脂質體紅血球血影細胞

固定化酶在分析化學中的應用

固定化酶在生化分析和臨床檢驗中的應用也是一個十分重要的領域，它的發展非常迅速，這不僅因為它們比較穩定，可反復使用，能實行自動化、連續化等，而且因為它們對抑制劑和活化劑比較不敏感，因此可用於較複雜體系的檢測。分析化驗中應用的固定化酶大體分為兩類：酶感測器(酶電極)

固定化酶柱檢測器,包括固定化酶柱和檢測器

固定化酶與基礎理論

1、用固定化酶研究亞基間關係：在適宜的條件下將寡聚體酶的一個亞基和載體偶聯固定變性並除去其他亞基複性及活性檢測亞基重組和酶性質的測定

2、應用固定化雙酶或多酶系統進行模擬試驗能獲得一些有意義的結果將己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶固定化在一起，結果觀察到偶聯反應的初速度顯著升高，而中間產物積累達到恒態水準所需的潛伏期大大縮短甚至消失。將上述兩種酶和ATP再生系統同固定於白蛋白上，然後用能透過葡萄糖、但不能透過葡萄糖-6-磷酸的膜進行包埋，結果，在體外實現了“反抗”濃度梯度的葡萄糖的“活性運轉”。3、通過固定化技術來改變酶的特性是酶分子修飾模擬的一個方面內容。

酶活性調節方式

酶活性调节的实例：

凝血酶、胰蛋白酶激活

糖元磷酸化酶活性转化

母體分娩後母乳中乳糖合成

丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶活性

苏氨酸到异亮氨酸的代谢途径控制

多種調節方式：

濃度調節（合成降解調節)；

生理調節(激素調節)；

共價修飾調節（可逆，不可逆)；抑制劑調節；

回饋調節（別構調節）；

存在方式調節（多酶體系）；

寡聚酶的聚合、解聚調節；

1.調節酶在細胞內的濃度

如：大腸桿菌的葡萄糖效應，即在有葡萄糖存在時，它不利用乳糖。原理可以用乳糖操縱子模型來解釋。

腺苷酸環化酶

AMPcAMP+H2O

磷酸二脂酶乳糖操縱子模型

2.

生理調節或激素調節在特殊生理條件下，分泌某一種激素來調節酶的活性。如：乳腺組織中的乳糖合成酶。

乳糖合成酶是蛋白A和蛋白B兩組分構成的複合物，可以催化乳糖合成反應：

EUDP-半乳糖+葡萄糖乳糖+UDP

蛋白A不能催化上述反應而能催化下述合成反應：UDP-半乳糖+N-乙醯葡糖胺N-乙醯半乳糖胺+UDP

蛋白B本身無催化能力，但其與蛋白A結合，可以改變蛋白A的底物專一性。A

3、共價修飾調節

不可逆共價調節——酶原啟動

◆一些酶（主要是消化酶和執行防禦功能的酶）在細胞內以無活性前體形式（即酶原）合成和分泌，然後輸送到胞內外作用部位去，當功能需要時就會被活化而起作用。可以想像，必須有一種調控機制，使其在胞內合成時處於失活狀態，而在需要時啟動；◆在酶原啟動過程中，酶原分子結構發生了這樣的變化：

首先，酶原分子被切去若干小段，即發生一級結構變化、

一級結構變化引起酶分子活性部位構象變化，形成能與特異性底物相結合的完整的疏水口袋。胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶Ser14—Arg15Thr147—Asn148A鏈B鏈C鏈胰凝乳蛋白酶原（無活性）π--胰凝乳蛋白酶（有活性）α--胰凝乳蛋白酶（有活性,穩定）α--胰凝乳蛋白酶（三鏈間有二硫鍵）◆α--胰凝乳蛋白酶為穩定的形式，A、B兩鏈及B、C兩鏈間各通過一對大的二硫鍵相連，其活性只有π--胰凝乳蛋白酶的2/5◆

酶活性中心的氨基酸殘基來自B、C二鏈

胰凝乳蛋白酶原受胰蛋白酶作用後，Arg15-Ile16間的肽鍵被打斷，形成了新的Ile16末端，這個新末端的氨基再與酶分子內部的Asp194發生靜電作用,

觸發一系列的構象變化：Met192從酶分子的深層移動到酶分子的表面，第187及第193殘基更加舒展等，這些改變的總結果是造成一個口袋——允許帶芳香族的底物或帶一個較大的非極性脂肪族鏈的底物進入專一性部位

消化系統其他蛋白水解酶原的啟動胃蛋白酶原（pepsinogen）由胃壁細胞分泌出來，在胃酸H+作用下，低於pH5時，酶原自動啟動，失去44個氨基酸殘基，轉變為高度酸性的，有活性的胃蛋白酶胰蛋白酶原（trypsinogen）進入小腸後，在有Ca2+的環境中受到腸激酶的啟動，賴氨酸-異亮氨酸之間的肽鍵被打斷，水解失去一個6肽，使構象發生一定變化後，成為有活性的胰蛋白酶羧肽酶原A彈性蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶羧肽酶原羧肽酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶對各個胰髒蛋白酶原的啟動作用

綜上所述，酶原啟動有兩個特點：是蛋白質肽鏈的水解過程，不可逆啟動後，不能變為酶原狀態，因而這是“一次性”的調節，能及時地從靶部位通過自身催化或組織蛋白酶的作用而降解移去都是通過級聯繫統實現的快速的信號放大過程，以完成特定功能

可逆的共價調節

由於其他的酶對其結構進行共價修飾，而使其在活性形式與非活性形式之間進行互變.第一種類型是磷酸化酶及其他的一些酶，它們通過接受ATP轉來的磷酸基的共價修飾，或脫下磷酸基，來調節酶活性：酶的無活性形式酶的有活性形式最典型的例子是動物組織中的糖原磷酸化酶：（葡萄糖）n+Pi（葡萄糖）n-1+1-磷酸-葡萄糖E糖原磷酸化酶的活性形式及非活性形式間的平衡，是磷酸基共價地結合到酶上或從酶上脫下，從而控制調節磷酸化酶的活性糖原磷酸化酶及其他受共價修飾調節的調節酶