食品微生物学（第二版） 课件 第七章食品微生物的生长及其控制

第七章食品微生物的生长及其控制学习目的与要求1.掌握微生物的生长规律及其测定、表达方式。2.掌握食品的腐败变质。3.掌握影响微生物生长的主要因素，有害微生物的控制等。（一）直接法1.测体积：细胞沉降物的体积2.测干重：离心或过滤后烘至干重（二）间接法1.比浊法：一定波长下，测定菌悬液的光密度（opticaldensity,OD）2.生理指标法：

如蛋白质、还原糖、总糖、核酸等含量的测定。因为每个细胞成分的含量是一定的，单位体积培养液中微生物群体细胞数目越多，总的细胞成分的含量就越多。第一节微生物生长繁殖的测定一、测生长量比浊法的特点：快速、简便1.血球计数板法原理：将1mm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如霉菌孢子、酵母菌等，不适用于细菌等个体较小的细胞。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。二、计繁殖数2.平板菌落计数法Astandardplatecount(viablecount)reflectsthenumberofviablemicrobesandassumesthateachbacteriumgrowsintoasinglecolony;platecountsarereportedasnumberofcolony-formingunits(CFU)perml(CFU/mL)orperg(CFU/g)ofsample.技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操作），严格无菌操作。适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物。误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作。

最常用的活菌计数法。将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保温培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可以计算出原菌液的含菌量。第二节微生物生长规律一、微生物的个体生长和同步生长同步生长：某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样的细胞生长和分裂周期中。同步培养：使群体中的细胞生长发育处于同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。获得同步生长的方法主要有两类：（1）环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等，造成与正常细胞周期不同的周期变化。（2）选择法：膜过滤、梯度离心、膜洗脱法，属于物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。二、无分支单细胞微生物的典型生长曲线典型的生长曲线的制作

将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。其它名称：延滞期、调整期、适应期（1）现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。（2）特点：生长速率常数R=0细胞形态变大或增长细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快,易产生诱导酶）对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）（3）原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物。1.迟缓期（lagphase）菌种：繁殖速度较快的菌种的迟缓期一般较短；接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其迟缓期较短，甚至检查不到延迟期；接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除迟缓期；培养基成分：

在营养成分丰富的天然培养基上生长的迟缓期比在合成培养基上生长时短；

接种后培养基成分有较大变化时，会使迟缓期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。种子损伤程度(4)影响迟缓期长短的因素(5)实践的指导意义在发酵工业上需设法尽量缩短迟缓期,采取的缩短的措施：①增加接种量（群体优势----适应性增强）；②采用对数生长期的健壮菌种；③调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。④选用繁殖快的菌种在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌。2.对数期（logarithmicphase）

其他名称：指数期（1）现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系（2）特点：R最大，即代时最短细胞进行平衡生长：菌体大小、形态、生理特征等一致代谢最旺盛（3）应用意义①由于此时期的菌种比较健壮，是增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。细胞呈指数增长示例特征:每经历一个代时，细胞的数目就增加1倍，呈指数增加，因而被称为指数生长。指数生长可以用下式表示：

N=N0×2nN0,N和t可由试验获得，n可通过上式计算得出，将等式两侧取对数重排后得：

lgN=lgN0+nlg2

lgN-lgN0

lgN-lgN0

lg20.301

式中：B

为起始细胞数目，

b

为指数生长某个时刻t时的细胞数目，

n

为世代数n===3.3*(lgN-lgN0）例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（B），经4h（t）后增加到49，000，000（b）这样，n＝(lg（4.9×107）－lg（1.2×104））÷0.301＝12借助于n和t，还可以计算出不同培养条件下的代时（G）

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。

由一个细胞分裂成为两个细胞的间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（Ｇenerationtime,G），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需的时间，有时也称为倍增时间。生长速率常数（R）：每小时分裂的次数在本例中，R=1/G=12/4=3代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为1～3h,然而有些快速生长微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天。同一种微生物，在不同的生长条件（营养成分、营养物浓度、培养温度）下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。温度（℃）代时（分）温度（℃）代时（分）10860352215120371720904017.525404520302947.577E.coli在不同温度下的代时营养物质浓度对微生物生长速度和菌体产量的影响只有在营养物质浓度很低（0.1-2.0mg/mL）时才会影响微生物的生长速度。随着营养物质浓度的提高（2.0-8.0mg/mL），生长速度不受影响，仅影响到最终的菌体产量。进一步提高营养物质的浓度，不再影响生长速度不和菌体产量生长限制因子：处于较低浓度范围内，影响生长速率和菌体产量的营养物质。可能是碳源、氮源、无机盐或生长因子3.稳定期（stationaryphase）又称：恒定期或最高生长期（1）现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。（2）特点：R等于零，新增殖的细胞数与衰亡的细胞数几乎相等，微生物的生长处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。细胞分裂速度下降，开始积累内含物，某些产芽孢的细菌开始形成芽孢。此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。（4）应用意义：①发酵产物形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上可以通过补充营养物质（补料）、调节pH、温度等措施尽量延长此期，提高产量。②稳定期细胞数目及产物积累达到最高。（3）产生原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，如C/N不合适;有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）；物化条件（pH、氧化还原势等）不合适。4.衰亡期（declinephase）（1）现象：活菌数急剧下降。（2）特点：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”，R为负值。细胞空泡更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶。（3）产生原因：

生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡。分批培养（batchculture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入，不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养（continuousculture）：在一个恒定容积的流动系统中培养微生物，一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物（菌体和代谢产物），让培养的微生物能以恒定的比生长速率生长，并持续生长下去的培养方法。连续培养的优点：高效，自控，质量稳定，节约。连续培养的缺点：菌种易退化，易污染，原料利用率低。三、微生物的连续培养装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度(内控制)无限制生长因子不恒定最高大量菌体或与菌体形成相平行的产物生产为主恒化器培养基流速（外控制）有限制生长因子恒定低于最高不同生长速率的菌体实验室为主恒浊器与恒化器的比较第三节影响微生物生长的主要因素适宜的环境→正常地进行生命活动不适宜的环境→正常的生命活动受到抑制或被迫暂时改变原有的一些特性恶劣的环境→死亡或发生变异影响微生物生长的环境条件物理条件温度表面张力辐射液体静压力声能化学条件氢离子浓度氧化还原电位氧气（一）微生物生长的适宜温度1.生长温度三基点（threecardinalpoint）最低生长温度最适生长温度（生长繁殖速率最大）最高生长温度。一、温度最低：一般为-10~-5℃，极端嗜冷菌为-30℃最高：一般80~95℃，极端嗜热菌为105~150℃最适嗜冷菌：＜20℃，一般为15℃嗜温菌：20~45℃嗜热菌：＞45℃，一般为50~60℃室温菌：约25℃体温菌：约37℃2.微生物的生长温度三基点对某一具体微生物而言，其生长温度范围差异很大（宽温微生物、窄温微生物）。对同一种微生物来说，最适生长温度并非是一切生理过程的最适温度（→分段式变温培养）。3.几点重要提示微生物类型生长温度范围分布的主要处所最低最适最高低温型专性嗜冷-12℃5—15℃15—20℃两极地区兼性嗜冷-5—0℃10—20℃25—30℃海水及冷藏食品上中温型室温10—20℃20—35℃40—45℃腐生菌体温35—40℃寄生菌高温型嗜热30-50℃45—65℃＞100℃温泉、堆肥堆、热水、加热器、海底火山口等极端嗜热70—90℃4.基于最适生长温度的微生物分类（1）嗜冷微生物（psychrophiles）①分布：极地、深海、深湖、冷泉、高山、冰窖、冷藏库等。②嗜冷机制酶在低温下有效；膜中含有大量不饱和脂肪酸，在低温下可以保持流动性和成膜性。③与人类关系低温保藏食品腐败的主要原因之一；可以开发低温酶制剂。①定义：能在0℃下生长，最适生长温度为20~40℃。②常见种类荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）耐冷微生物（psychrotolerant）（2）嗜温微生物（mesophile）自然界绝大多数微生物属于此类。（3）嗜热微生物（thermophiles）主要指嗜热细菌。分布：草堆、厩肥、煤堆、温泉、火山地、地热区土壤、海底火山口附近、工厂的热水装置。嗜热微生物的嗜热机制酶具有更强的抗热性；核酸有保证热稳定性的结构；细胞膜中含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸；生长速率快（Q10=1.5~2.5），弥补高温造成的大分子破坏。嗜热微生物优点生长速率高，代谢活动强产物/细胞的重量比高培养时不怕杂菌污染嗜热酶在生产实践和科学实践中，应用前景广阔。Thermusaquaticus（水生栖热菌）Pyrococcusfuriosus（强烈炽热球菌）嗜热微生物的分类嗜热菌耐热菌：最高45~55℃，最低＜30℃兼性嗜热菌：最高50~65℃，最低＜30℃专性嗜热菌：最适65~70℃，最低42℃极端嗜热菌：最高＞70℃，最适＞65℃，最低＞40℃超嗜热菌：最高113℃，最适80~110℃，最低~55℃

微生物对于低温的敏感性较差，绝大多数微生物在低温下：只是减弱或降低代谢速度；菌体处于休眠状态；生命活力依然保存。（二）低温对微生物的影响1.冰冻对微生物的影响细胞内的游离水形成冰晶体，对细胞有机械性损伤；细胞内游离水被冰冻，造成干燥状态，细胞质浓缩；微生物所处的基质产生一系列复杂变化。最终导致微生物被抑制或致死。2.低温对微生物作用的有关因素温度；稍低于冰点（-2℃），菌数下降较多，再低于这个温度（-20℃以下），菌数下降较慢。微生物种类；干燥和真空；反复冻融；基质的成分、浓度、pH（三）高温对微生物的影响

在超过微生物的最高生长温度时，会引起其死亡。1.高温的致死作用机理引起蛋白质和核酸不可逆地变性失活；破坏细胞质中其他活性物质；细胞膜被热溶解形成小孔使胞内物质泄漏。2.影响微生物对热抵抗力的因素菌种菌龄菌体数量基质的因素（pH、渗透压、化合物）不同微生物的抗热性规律球菌＞非芽孢杆菌革兰氏阳性菌＞革兰氏阴性菌霉菌＞酵母菌霉菌和酵母菌孢子＞菌丝体芽孢和菌核抗热力特别大不同微生物的湿热灭菌条件细菌细胞：60~70℃，10min酵母菌细胞：50~60℃，5min霉菌菌丝体：62℃，30min病毒病毒粒：60℃，30min细菌芽孢：121℃，0.5~12min或100℃，2~800min酵母菌孢子：70~80℃，5min霉菌孢子：80℃，30min微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:二、氧气微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。

微生物种类最低pH最适pH最高pH大肠杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌一般霉菌一般放线菌一般酵母菌

4.34.54.21.55.02.56.0—8.06.0—7.57.0—7.53.8—6.07.0—8.04.0—5.89.58.59.37.0-11.0108.0三、pH值⑴引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收。⑵

影响代谢过程中酶的活性。⑶

改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。

微生物代谢活动常改变氢离子浓度

如：乳酸菌分解葡萄糖产生乳酸，pH值下降，

尿素细菌分解尿素产氨使pH上升。为了防止基质中的pH值发生过大的变化影响微生物生长，在配制培养基时通常加入缓冲剂。pH值对微生物生长的影响生长的最适pH值与发酵的最适pH值同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH值要求不同。例如：丙酮丁醇梭菌在pH值=5.5～7.0时，以菌体生长为主在pH值=4.3～5.3时，进行丙酮丁醇发酵同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累不同的代谢产物。例如：黑曲霉pH值=2～3时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。pH值≈7时，产物以草酸为主，只产少量柠檬酸。第四节微生物的培养方式1.好氧培养方法（1）固体好氧培养方法一、实验室培养法琼脂斜面琼脂平皿培养（2）液体好氧培养方法恒温振荡培养箱实验室小型全自动发酵罐2.厌氧培养方法实验室培养厌氧菌除需要特殊培养装置（厌氧罐、厌氧手套箱）或器皿（厌氧培养皿）外，还须配置特殊的培养基——需加入还原剂及刃天青等氧化还原指示剂。厌氧罐厌氧手套箱Hungate滚管技术PRAS培养基（pre-reducedanaerobicallysterilizedmedium）1.固态培养法（1）好氧：各种曲法培养如食用菌栽培中的袋曲、酱油发酵中的厚层通风制曲（2）厌氧：白酒地窖式堆积发酵2.液态培养法（1）好氧：①静止：早期柠檬酸发酵使用浅盘培养②搅拌：液体深层通气培养（2）厌氧：丙酮丁醇发酵使用无通风搅拌装置的深层培养二、生产实践中培养法工业发酵车间第五节食品腐败与微生物一、食品腐败变质的过程肉、蛋、鱼和豆制品等富含蛋白质的食品，经过微生物的蛋白酶和肽酶的作用，蛋白质被分解成多肽及氨基酸，氨基酸再进一步分解成相应的胺类、有机酸和各种碳氢化合物。食品中蛋白质的分解（腐败）含碳水化合物较多的食品主要是粮食、蔬菜、水果和糖类及其制品，在微生物及动植物组织中的各种酶及其它因素作用下，这些成分可发生水解并顺次形成低级产物，如单糖、醇、醛、羧酸直至二氧化碳和水。食品中碳水化合物的分解（发酵）脂肪水解形成的脂肪酸形成有不愉快味道的酮类或酮酸、过氧化物、有臭味的醛类和醛酸的过程，即所谓的“油哈”味油脂自身的氧化是食品中脂肪分解的主要原因，脂肪酸在光、氧气及金属等触媒的影响下发生自由基氧化反应，生成过氧化氢化物、羰基化合物（醛、酮、醇等）、羟酸、脂肪酸聚合物、缩合物。食品中脂肪的分解（酸败）有害物质的形成

微生物产生的毒素分为细菌毒素和真菌毒素，它们能引起食物中毒，有些毒素还能引起人体器官的病变及癌症。（一）鲜肉的腐败变质1.鲜肉中微生物的来源（1）屠宰前的微生物来源：体表、消化道、呼吸道、免疫器官（2）屠宰后的微生物来源：环境2.鲜肉中微生物的种类

细菌、霉菌、酵母菌。3.鲜肉变质的现象（1）发粘：微生物生长形成菌苔、产生黏液使肉表面出现发粘、拉丝等现象，此时微生物数量达到了107/cm2。（2）变色：微生物分解含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢与肌肉组织中的血红蛋白形成绿色的硫化氢血红蛋白、微生物生长产生色素等。（3）霉斑：特别是干腌肉制品，有颜色斑块。（4）气味改变：酸味、臭味、哈喇味。二、常见食品的腐败变质1.牛乳中微生物的来源（1）乳房内的微生物污染①在健康乳牛乳房的乳头管及其分支内，常有许多细菌存在②当发生乳房炎时，牛乳中会出现乳房炎病原菌，如无乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌等。（2）环境中的微生物污染（二）鲜乳的腐败变质2.牛乳中的优势微生物种类

鲜牛乳中的微生物优势种类是细菌、酵母菌和少数霉菌。即：乳酸菌胨化细菌脂肪分解菌酪酸菌产生气体的细菌产碱菌（2）霉菌和酵母菌（1）细菌3.鲜乳变质时的微生物变化鲜乳中微生物的活动曲线（三）鱼类的腐败变质1.鱼中微生物的来源（1）捕获前：水中的微生物（2）捕获过程使用过的鱼仓、渔具、甲板及捕获人员的手等2.鱼中微生物的种类假单孢菌属、无色杆菌属、黄杆菌属、不动杆菌属、拉氏杆菌属和弧菌属的细菌。

3.细菌侵入鱼体的途径：体表黏液、鱼鳃、消化道(四）蛋类的腐败变质1.鲜蛋中微生物的来源：卵巢内、泄殖腔、环境2.鲜蛋的变质：腐败（细菌引起）、霉变3.鲜蛋中微生物类群：有细菌、霉菌等；病原菌如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。（五）果蔬的腐败变质1、果蔬中的微生物种类：霉菌、酵母菌、少数耐酸细菌2、微生物侵入果蔬的过程：霉菌→酵母菌、细菌马铃薯灭菌（sterilization）采用强烈的理化因素，使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。防腐（antisepsis）利用理化因素防止或抑制微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生腐败或霉变的措施。消毒（disinfection）采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施。商业灭菌（commercialsterilizalation）食品经过杀菌处理后，按照所规定的微生物检验方法，在所检食品中无活的微生物检出，或者仅能检出极少数的非病原微生物，并且它们在食品保藏过程中，不能进行生长繁殖的灭菌方法。第六节食品中有害微生物的控制几个重要概念一、物理方式表6-1常用的物理方法电热鼓风干燥箱150~160℃1~2h热对微生物的致死作用（1）热力致死时间（TDT）：在特定条件和特定的温度下，杀死一定数量微生物所需要的时间。（2）D值：在一定温度条件下，杀死某样品中90%微生物或孢子或芽孢所要的时间。

如D100=10min

Dr中r代表121.1℃（3）Z值：在加热致死时间曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90%加热时间）所要升高的温度。（4）F值：在一定的基质中，温度为121.1℃，加热杀死一定数量微生物所需的时间。残存活细胞曲线热致死时间曲线习题已知牛奶中的初始细菌数为106CFU/mL，经过巴氏消毒后，牛奶中残存的