亳菊组培快繁与脱毒技术规程编制说明

地方标准编制说明标准名称亳菊组培快繁与脱毒技术规程任务来源（项目计划号）皖市监函〔2022〕550号“安徽省市场监督管理局关于下达2022年第二批安徽省地方标准制修订计划的通知”，共计229项。项目计划号：2022-2-184负责起草单位安徽农业大学单位地址参与起草单位安徽农业大学、亳州兴禾农业发展有限公司、安徽省亳州中医药集团有限公司、安徽省农业科学院园艺研究所、安徽中药材种植联合研究中心标准起草人（全部起草人，应与标准文本前言中起草人排序一致）序号姓名单位职务职称电话12345678910111213编制情况1、编制过程简介2022年9月26日，收到《安徽省市场监督管理局关于下达2022年第二批安徽省地方标准制修订计划的通知》后，成立标准编制小组，成员有高俊山、刘凯、李大辉、赵梦茹、黄举飞、李卫文、周雪娟、陈情情、郭宁、杨忠、刘威、牛岩岩、陈娜。标准起草过程：2021年3月-2021年12月完成资料收集工作；2022年9月26日公示，正式立项；2022年10月1日-2023年11月30日在课题研究及实地调研的基础上，确定标准编制工作的整体框架和详细计划，并完成标准初稿的制定工作；2023年12月向社会公开征求意见，并形成“征求意见稿”。征求意见情况：XXXX年XX月，由工作组牵头负责通过网站宣传、杂志登载、文稿邮寄、会议等方式公开征求意见，共向XX个有关行业单位、科研院所、大专院校及有代表性的标准利益方发函征求意见。截止XXXX年XX月底，本次征求意见共收到X家单位XX条意见，最终XX条采纳，XX条未采纳。审查情况：XXXX年XX月XX日，XXXXX在XX组织召开了《XXXXXX》地方标准审查会，来自XXXX等单位专家组成审查专家组。专家委员会认真听取了编制单位的汇报，审阅了相关材料，经质询和讨论，提出了XX条修改建议，并一致认为，XXXXXXXXXXXXXXX，建议修改完善后报批。报批情况：工作组根据审查意见对标准送审稿作了修改和完善，于XXXX年XX月形成标准报批稿、编制说明及其它相关文件，报至XXXXXXXX。2、制定标准的必要性和意义亳菊[Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.‘Boju’cv.nov.]为菊科多年生宿根草本植物,花朵大、色白，主产地在安徽亳州、涡阳一带,栽培历史悠久。《中药大辞典》中记载:“白菊产安徽亳州,称亳菊,品质最佳”。《中国药典》(2020年版)收录亳菊为中药材，是我国四大名菊之一。作为药用菊花，亳菊花中含有绿原酸、木犀草苷、黄芩苷、槲皮素和金合欢素等有效成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降压和保护心血管等作用，用于风热感冒、头疼眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒等，在医药上具有广泛的应用。亳菊是传统的常用大宗药材，药用品种丰富，但在亳菊长期栽培过程中，药农只种不选，自繁自留，而且不同区域，品种种苗混用，近缘物种杂交，导致病毒感染、种质混乱、种性退化严重，进而使亳菊抗逆性减弱、产量下降、品质不稳。同时，由于亳菊连年无性繁殖，病毒积累日趋严重，造成亳菊生长发育不良和品种退化，农民种植效益低下，亳菊种植面积逐年减少，正面临着极大的困境。本规程探讨亳菊组织培养的快繁与脱毒技术，通过脱毒快繁、提纯复壮、规范栽培等研究，筛选最优技术方案，为亳菊品种的提纯复壮，加快亳菊无病毒种苗繁育,促进亳菊规范化生产,恢复亳菊种植面积，确保亳菊的药用价值提供理论依据。3、制定标准的原则和依据，与现行法律法规、标准的关系。本标准制定的原则是在对国内相关方法标准和技术资料调查研究的基础上，结合实验研究数据，既考虑技术的科学性，又考虑实际的有效性和可操作性；既考虑遵循统一的国家标准以及出口质量检测项，又考虑环境保护的特点，力求制定规范，简便易懂，切实可行。4、主要条款的说明，主要技术指标、参数、试验验证的论述（详细说明）4.1主要条款本文件的章节由术语和定义、外植体材料选择、消毒灭菌、初代培养、继代培养、生根培养、病毒检测、炼苗移栽及苗床管理等主要部分组成。本文件规定了本规程的术语和定义、外植体材料选择、消毒灭菌、初代培养、继代培养、生根培养、病毒检测、炼苗移栽及苗床管理等。4.2主要技术指标、参数、试验验证的论述主要技术指标、参数、试验验证的论述来自于试验取得的结果和相关文献的查阅，主要内容如下：4.2.1外植体材料选择供试材料采自安徽亳州兴禾农业发展有限公司中药材种植示范园区。为多年生草本，高70～90cm，茎直立，多分枝，被白色绒毛。叶淡绿色，卵状三角形，长4.0～5.5cm，宽3.5～5.2cm。叶两面均被白色绒毛，叶羽状裂，叶缘具钝锯齿。头状花序着生枝上部，疏散排列成伞房状。花序直径3.05.0cm，总苞3～4层，舌状花白色或微黄色,8～12层。管状花少，黄色。每花序有舌状花148～286朵,管状花4～50朵。选取当年种植的亳菊植株，将大小适宜的亳菊嫩茎作为外植体材料。4.2.2消毒灭菌取当年生长约20.0cm幼嫩茎段，先用自来水冲洗30分钟去除表面泥土灰尘，然后移至超净工作台。将嫩茎置于无菌瓶中，倒入适量75%乙醇，使嫩茎浸泡并震荡无菌瓶消毒30s，迅速倒出酒精，再用0.1%HgCl2浸泡消毒8～10min，期间不断震荡，倒出升汞后用无菌水冲洗4～5次，静置晾干待用。4.2.3初代培养取消毒处理后的亳菊嫩茎，在解剖镜下仔细剥离0.3～0.5mm茎尖，接种于不同激素配比的初代诱导培养基上，以MS为基本培养基，不同激素配比为：①MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7.5g/L；②MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7.5g/L；③MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7.5g/L。以每瓶接种3-5个茎尖，每个处理接种10瓶，放置在温度25±2℃，光照16h/天，光照强度1500～2000lx的培养室中培养，30d左右统计结果。如表1所示，接种7d后，生长点开始膨大，30d左右绿色芽点冒出，继而分化出不定芽或愈伤组织。随着6-BA浓度的增加，愈伤组织大量形成，且丛生芽的质地逐渐变脆，而NAA浓度水平的提高易增加愈伤组织的形成。试验结果表明，当6-BA为2.0mg/L、NAA为0.2mg/L时能够分化出大量丛生芽，且芽苗壮实，无愈伤组织，为亳菊丛生芽分化的最佳培养基配方。表1不同激素配比诱导丛生芽情况4.2.4继代培养将经过初代诱导培养获得的丛生芽或组培苗切成1.5-2cm带有2-3个叶片的茎段，接种至增殖壮苗培养基中，培养基配方为：①MS；②MS+6-BA0.10mg/L；③MS+6-BA0.30mg/L；④MS+6-BA0.50mg/L。每瓶接种8-10个茎段，放置在温度25±2℃，光照16h/天，光照强度2200～4000lx的培养室中培养，20d左右观察植株的长势。由表2可知，随着6-BA浓度的增加，植株颜色逐渐加深，植株长高逐渐变缓，长势无明显差别，基于成本等因素考虑，选择MS培养基作为增殖培养的培养基。表2增殖培养结果4.2.5生根培养将增殖培养获得的高度约为7-8cm的丛芽分离成单株，并切成3-4cm带有3-4个叶片的茎段，以每瓶6-8株接种至生根培养基，配方为：①1/2MS；②1/2MS+NAA0.30mg/L；③1/2MS+NAA0.50mg/L；④1/2MS+IBA0.30mg/L；⑤1/2MS+IBA0.50mg/L。放置在温度25±2℃，光照16h/天，光照强度2200～4000lx的培养室中培养，观察生长情况。由表3可知，亳菊生根较易，在5种生根培养基中培养7d后均有白根生出，加有IBA的④和⑤号培养基接种5d就有新根长出，综合根数和根系生长状况，亳菊生根最优配方为④号培养基:1/2MS+IBA0.30mg/L。表3试管苗生根培养结果4.2.6病毒检测对即将炼苗的植株进行病毒检测。采用PCR法对亳菊组培苗TAV、CMV、CVB、CSVD等病毒进行检测。4.2.7炼苗在组培瓶中生长的根、茎、叶俱全的完整植株，将生长健壮、叶色正绿平展、根长2-4cm、高4-6cm的亳菊生根苗在温室内进行闭瓶炼苗，然后打开瓶塞，移至温室强光下炼苗3-5d后移栽。4.2.8移栽在保证组培穴盘苗正常生长的前提下，可因地制宜选择基质种类。基质开袋倒槽，装入穴盘中并稍压紧待用。将水池用75%酒精喷洒消毒5min，随后用自来水冲洗干净。蓄水池内加入适量的水，轻轻取出炼苗驯化后的组培苗，用水洗净根部附着的培养基且尽量防止伤苗，对洗净后的亳菊苗进行75%酒精喷洒消毒，放置1-2min后清水冲净。将穴盘基质挖出深2-4cm，直径3cm的槽，然后把清洗处理后的苗移栽到槽中，填土轻轻按平。4.2.9放置苗床配置2000倍枯草芽孢杆菌和1000倍矿源黄腐酸钾用喷雾机进行喷洒，使其充分浇匀浇透。穴盘苗分移栽日期，在苗床上整齐摆放。4.2.10苗床管理移栽后用遮阳网遮阳，炼苗后遮阳时间不少于7天，然后遮阳率调为75%左右最适宜亳菊苗健康生长。据天气情况与季节特性及时浇水，保持土壤含水量50%-60%，且每次浇水都辅以2000倍枯草芽孢杆菌进行喷灌。炼苗7天后可以进行施加1000倍矿源黄腐酸钾促进其根生长，后续可每隔10天进行喷洒1000倍枯草芽孢杆菌进行病虫害防治和1000倍史丹利20-20-20保证土壤的肥力。参考文献：[1]陈好,莫丽文,王泽峰等.地被菊花‘珍粉’组织培养与植株再生体系的建立[J].分子植物育种,2023,21(05):1633-1640.[2]张冰,杨星宇,骆美雯等.黄菊花组织培养研究进展及不同植物生长调节剂配方对愈伤组织诱导情况的研究[J].乡村科技,2022,13(09):82-84.[3]武颖.菊花“粉十八”组织培养技术研究[J].现代园艺,2022,45(14):13-15.[4]曲晓慧.几种菊属野生植物再生体系的建立[D].南京农业大学,2022.[5]王俊侠,刘全凤,王静等.名贵菊花试管苗生根与移栽试验研究[J].现代园艺,2020,43(01):24-25.[6]赵维萍,王艳琪,刘洋等.药用菊花组织培养技术研究进展[J].安徽农学通报,2019,25(12):36-38+44.[7]邓丽娟,万子昱,骆淑媛.激素对菊花组织培养的影响[J].绿色科技,2018(24):177-178.[8]江芹,李卫文,董玲,廖华俊,俞年军.亳菊的组织培养快繁技术研究[J],安徽农业科学,2010,38(34):19343-19345.5、标准中如果涉及专利，应有明确的知识产权说明无6、采用