第八章 微生物的遗传变异与育种

第八章微生物的遗传变异与育种第一节遗传变异的物质根底第二节微生物的基因及基因组结构第三节质粒和转座因子第四节基因重组第五节基因突变与微生物育种第六节微生物基因工程第七节菌种的衰退、复壮与保藏遗传与变异的概念遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能，变异：生物体的遗传物质结构和数量的改变，在群体中以极低的几率〔10-5~10-6〕出现，性状变化幅度大；新性状稳定、可遗传。遗传型〔genotype〕：一个生物体所含有的基因的总和。表型〔phenotype〕：一个生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。饰变〔modification〕：指生物体由于非遗传因素引起的表型改变，变化发生在转录、转译水平，特点是几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化，性状变化的幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。举例：Serratiamarcescens的红色素在25℃和37℃的变化。表型饰变：表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为遗传型变异〔基因变异、基因突变〕：遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为〔自发突变频率通常为10-6-10-9〕Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens.

Fromlefttoright:slantculturegrownat25°C,slantculturegrownat37°C,brothculturegrownat25°C,brothculturegrownat37°C.

饰变〔modification〕：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。研究微生物遗传的意义微生物的独特生物学特性：〔1〕 个体的体制极其简单；〔2〕 营养体一般都是单倍体；〔3〕 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；〔4〕 繁殖速度快；〔5〕 易于积累不同的中间代谢产物或终产物；〔6〕 菌落形态特征的可见性和多样性；〔7〕 环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；〔8〕 易于形成营养缺陷型；〔9〕 各种微生物一般都有相应的病毒；〔10〕 存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学根本理论问题中最热衷的研究对象。对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的开展，而且为育种工作提供了丰富的理论根底，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向开展。研究微生物遗传学的意义第一节遗传变异的物质根底种质连续理论：1883~1889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。基因学说：二十世纪初发现了染色体并提出基因学说，使得遗传物质根底的范围缩小到染色体上。染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以到达一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质根底的证明：1944年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验〔肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验〕1928年，Griffith进行了以下几组实验：〔1〕动物实验

对小鼠注射活R菌或死S菌————小鼠存活

对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡

对小鼠注射活R菌和热死S菌———小鼠死亡抽取心血别离活的S菌

一、三个经典实验〔一〕经典转化实验〔transformation〕：研究对象：Streptococcuspneumoniae〔肺炎双球菌〕S型菌株：有致病性，菌落外表光滑，有荚膜R型菌株：无致病性，菌落外表粗糙，无荚膜〔2〕细菌培养实验

热死S菌—————不生长

活R菌—————长出R菌

热死S菌+活R菌—————长出大量R菌和10-6S菌〔3〕S型菌的无细胞抽提液试验

活R菌+S菌无细胞抽提液————长出大量R菌和少量S菌以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白质⑥加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌1944年、和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。〔二〕噬菌体感染实验实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。〔三〕植物病毒的重建实验为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat〔1956〕用含RNA的烟草花叶病毒〔TMV〕进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相别离。别离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型病症，而且在病斑中还能别离出正常病毒粒子。〔三〕植物病毒重建实验实验证明，遗传信息的流向与DNA的传递是一致的。朊病毒的发现和思考朊病毒含有微量的核酸，仍未发现？朊病毒仅由蛋白质构成朊病毒的遗传物质为蛋白质？第二节微生物的基因组结构

基因的定义 基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。一、基因的概念1.染色体是基因的载体或转运者，允许基因有序别离与组合；2.基因是最小重组单位，不可分，交换只能发生在基因间；3.基因是最小突变单位，以一个整体进行突变，内部不再有可变化的更小组分；4.基因是一个功能单位。它控制有机体某个或一些性状。可将重组单位和突变单位合称为结构单位，因而基因既是一个结构单位，又是一个功能单位。基因结构研究的历史

从遗传学史的角度看，基因概念大致分以下几个阶段：泛基因〔或前基因〕孟德尔（遗传因子）摩尔根（基因）顺反子操纵子现代基因现代基因阶段基因的分类 将编码蛋白质的基因根据其是否具有转录和翻译功能可以把基因分为三类。具有转录和翻译功能；只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因；不转录的基因，它对基因表达起调节控制作用，包括启动基因和操纵基因。原核生物的基因结构编码区非编码区非编码区RNA聚合酶结合位点原核细胞基因结构示意图真核生物的基因结构真核细胞基因结构示意图编码区非编码区非编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子外显子和内含子真核细胞基因结构的主要特点编码区是间隔的、不连续的。外显子在编码区能够编码蛋白质的序列内含子在编码区不能够编码蛋白质的序列真核细胞中，外显子和内含子数目不同蛋白质碱基外显子内含子氨基酸Β-球蛋白170032146凝血因子1860026252552

基因组：细胞中基因以及非基因的DNA序列的总称，包括结构基因、调控序列以及目前功能未知的DNA序列。

二、基因组原核生物〔大肠杆菌〕的基因组紧密缠绕的环状双链DNA分子遗传信息的连续性功能相关的结构基因组成操纵子结构结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝基因组的重复序列少而短古细菌〔詹氏甲烷球菌〕的基因组古细菌的基因组结构类似于细菌，即在环形DNA分子上功能相关的基因组成操纵子结构，无内含子序列。负责信息传递功能的结构〔复制、转录和翻译〕类似于真核生物，如启动子结构、复制起始因子、RNA聚合酶、翻译延伸因子等真核生物〔啤酒酵母〕的基因组DNA与组蛋白构成染色体有间隔子或内含子序列没有明显的操纵子结构含有一定数量的重复序列〔低度、中度和高度重复〕遗传丰余：较高同源性的DNA重复序列第三节质粒和转座子一、原核生物质粒的概述定义：是一类小型共价闭合环状核外DNA，能独立于细胞核进行自主复制。可以通过交换掺入细胞核成为附加体；可以从寄主细胞中消除。近年来也发现了线性双链DNA质粒和RNA质粒大小：2~100×106Da，含有数个到数十个甚至上百个基因。性质：质粒是一种复制子，分为严紧型和松弛型，严紧型质粒的复制受细胞核控制，一般一个寄主细胞内有2~3个；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在细胞内的数量可以到达10-15个功能：进行细胞间接合并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、降解功能等。重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。原核生物的质粒存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、StreptococcuslactisAgrobacteriumtumefaciensetal制备：包括增殖、裂解细胞、别离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法二、原核生物的质粒A定义质粒〔plasmid〕：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。B结构特点通常以共价闭合环状(covalentlyclosedcircle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；

细菌质粒多在10kb以内严紧型质粒(stringentplasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数松弛型质粒(relaxedplasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数窄宿主范围质粒(narrowhostrangeplasmid)〔只能在一种特定的宿主细胞中复制〕广宿主范围质粒(broadhostrangeplasmid)〔可以在许多种细菌中复制〕三、质粒的主要类型〔一〕致育因子(Fertilityfactor，F因子)致育因子/性因子，62×106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因〔tra区〕与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象〔接合作用〕有关的质粒。携带F质粒的菌株称为F+菌株〔相当于雄性〕，无F质粒的菌株称为F-菌株〔相当于雌性〕。F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。〔二〕抗性因子〔Resistancefactor，R因子〕包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。R质粒抗性转移因子〔RTF〕：转移和复制基因抗性决定因子：抗性基因〔三〕Col因子〔colicinogenicfactor〕产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种由E.coli的某些菌株所分泌的细菌蛋白，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死不含Col因子的近缘的其它肠道细菌。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。有些G+细菌也产生细菌素，如用于食品保藏的NisinColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA的研究和用于体外复制系统上。〔五〕代谢质粒如假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM〔樟脑〕质粒，XYL〔二甲苯〕质粒，SAL〔水杨酸〕质粒，MDL〔扁桃酸〕质粒，，NAP〔奈〕质粒和TOL〔甲苯〕质粒等。〔四〕毒性质粒四、转座因子的主要类型和分子结构插入〔IS〕序列转座子(Tn)特殊病毒〔Mu噬菌体〕定义：可在DNA链上改变自身位置的一段DNA序列。原核生物中的转座子类型插入序列〔IS，insertionsequence)分子量最小〔仅0.7~1.4kb〕，只有引起转座的转座酶基因而不含其它基因，具有反向末端重复序列。已在染色体、F因子等质粒上发现IS序列。E.coli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS，通过这些同源序列间的重组，就可使F因子插入到E.coli的核染色体组上，形成Hfr菌株。因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS被切离时引起的突变可以回复，如果因切离部位有误而带走IS以外的一局部DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。

转座子〔Tn，transposon)转座子又称转位子或易位子分子量居中〔一般为2~25kb〕。除了与转座作用有关的基因外，还含有抗性基因〔对抗生素、某些毒物〕、乳糖发酵基因等几个至十几个基因。从结构来看，Tn有两种类型，即末端为反向或顺向重复的IS，或末端为反向重复的序列。Tn虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但并不完全是随机的，某些区域更易插入。

Mu噬菌体〔即mutatorphage〕Mu噬菌体即诱变噬菌体是E.coli的一种温和噬菌体。含有噬菌体生长繁殖和转座所必需的基因，其分子量最大〔39kb〕，含有20多个基因，但并没有固定的整合位置。Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变。五、转座的遗传效应插入突变产生染色体畸变〔复制性转座子〕基因的移动和重排第四节微生物的基因重组基因重组〔generecombination〕：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。重组是分子水平上的一个概念，而一般所说的杂交〔hybridization〕那么是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组那么不限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交、准性杂交〔parasexualhybridization〕等原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。基因重组的意义

原核微生物的基因重组

转化转导接合原生质体融合基因重组的方式一、转化〔transformation〕转化或转化作用：受体菌〔recipient或receptor〕直接吸收了来自供体菌〔donor〕的DNA片段，通过交换整合到自己的基因组中，从而获得局部新的遗传型状的现象。接受了供体菌DNA的受体菌称为转化子〔transformant〕。范围：原核生物中，转化是一个较普遍的现象。假设干放线菌和蓝细菌及少数真核微生物也有转化报道。转化发生的条件两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的那些种中，其不同菌株间也不一定都可发生转化。进行转化的受体细胞必须处于感受态〔competence〕，亦即受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。也可以采用人工的方法使细菌转变成感受态感受态因子：一种细胞外蛋白，可与受体菌细胞外表的特异受体结合，结果激活细胞内一系列与转化有关的基因的表达，其中产生的自溶素使细胞外表的DNA结合蛋白和核酸酶裸露出来，以完成转化过程。不同细菌，每个细胞上的DNA结合位点数不同。转化因子的本质一般是DNA，经屡次提纯操作后，每一转化DNA片段的分子量都小于1×107，约占细菌核染色体组的0.3%。据研究，呈质粒形式的转化因子，其转化频率最高；一般的转化因子都是线状双链DNA；也有线状单链DNA具有转化作用的报道。转化过程：以S.Pneumonia为例分为六阶段：双链DNA片段与感受态受体菌细胞外表的DNA结合位点〔主要在新形成细胞壁的赤道区〕结合；在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为4~5×106的DNA片段；DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5×105的DNA片段不能进入细胞。来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对交换，形成了一个杂合DNA区段〔heterozygousregion〕。在这一过程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与；受体菌的染色体组进行复制，杂合区段别离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。转化过程〔革兰氏阳性菌的转化模型〕噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染(transfection)：转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的〔而非感染〕途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。转化过程的特点：a〕对核酸酶敏感；b〕不需要活的DNA供体细胞；c〕转化是否成功及转化效率的上下主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d〕通常情况下质粒的自然转化效率要低得多人工转化用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。不是由细菌自身的基因所控制；质粒的转化效率高；二、接合(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。接合机制(大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。F因子为附加体质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入〔整合〕到染色体上F因子的四种细胞形式a〕F-菌株(“雌性〞菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b〕F+菌株(“雄性〞菌株)，F因子独立存在，细胞外表有性菌毛。c〕Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞外表有性菌毛。d〕F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞外表同样有性菌毛。1〕F+×F-杂交理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。a〕F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；b〕F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。c〕F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的F因子。d〕复制完成后，F-细菌变成F+，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+的拷贝。所以最终杂交的结果是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌那么不变。Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把局部甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。2〕Hfr×F-杂交Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leadingregion)结合着染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区以外，其余绝大局部是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的时机就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。利用Hfr×F-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。3〕F′×F-杂交Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。F′×F-与F+×F-的不同：供体的局部染色体基因随F′一起转入受体细胞a〕与染色体发生重组；b〕继续存在于F′因子上，形成一种局部二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为性导〔sexduction〕、F因子转导〔F-duction〕，或F因子媒介的转导〔F-mediatedtransduction〕。三、转导〔transduction〕由缺隙噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式

一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中细菌转导的类型：普遍转导局限转导完全普遍转导流产普遍转导低频转导高频转导普遍性转导〔generalizedtransduction〕定义：通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包〞而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。完全(普遍性)转导：completetransduction。1952年发现，在Salmonellatyphimurium中存在转导现象。在它的完全普遍性转导实验中：以其野生型菌株作为供体菌营养缺陷型菌株作为受体菌P22噬菌体作为转导媒介，对供体菌是烈性噬菌体，对受体菌是温和噬菌体流产普遍性转导〔abortivetransduction〕概念：受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译〔性状表达〕，这种现象就称为流产转导。现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物——酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释，所以，能在选择性培养基平板上形成微小菌落就是流产转导的特点。局限性转导定义：通过局部缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。特点：噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体只能转导供体菌的个别特定基因〔一般为噬菌体整合位点两侧的基因〕该特定基因由局部缺陷的噬菌体携带缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率〔约10–5〕“误切〞，或由于双重溶源菌的裂解而形成〔约形成50%缺陷噬菌体〕分类：低频转导与高频转导转导的过程该溶源菌被诱导裂解时，有极少数〔~10–5〕的前噬菌体〔prophage〕发生不正常切离〔abnormalexcesion〕，其结果会将插入位点两侧之一的少数宿主基因〔如E.coli前噬菌体的两侧分别为发酵半乳糖的gal基因或合成生物素的bio基因〕连接到噬菌体DNA上〔而噬菌体也将相应的一段DNA遗留在宿主的染色体组上〕，通过衣壳的“误包〞，就形成了一种特殊的噬菌体——缺陷噬菌体〔defectivephage〕。它们没有将宿主溶源化的能力，而是使宿主成为一个局限转导子，对噬菌体没有免疫性。温和噬菌体感染受体菌后，其DNA会开环，以线状形式整合到宿主染色体的特定位点上，从而使宿主细胞发生溶源化，并获得对相同温和噬菌体的免疫性。一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的局部缺陷噬菌体的比例是极低的〔10–4~10–6〕。把这种裂解物称为LFT〔低频转导〕裂解物。低频转导〔LFT，lowfrequencytransduction〕E.coli

K12(

)gal+(供体菌)(大量)+dgal+（10-5）E.coliK12Sgal-(受体菌)E.coliK12Sgal-/

dgal+E.coliK12Sgal-/

dgal+/

E.coliK12Sgal-/dgal+/〔双重容源菌供体〕(50%)+dgal+〔50%〕E.coliK12Sgal-(受体菌)E.coliK12Sgal-/dgal+〔转导子〕高频转导和低频转导图解溶源转变概念：当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。性质：外表上与转导相似，而本质上不同于转导。区别：当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身基因使宿主获得新性状温和噬菌体使完整的，不是缺陷的获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子原生质体融合〔protoplastfusion〕概念：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。原生质体融合的优点：可以提高重组率双亲可以少带标记或不带标记可进行多亲本融合有利于不同种间、属间微生物的杂交通过原生质体融合提高产量原生质体融合操作示意图去壁

[A+B-]〔高渗下〕[A+B-]PEG或电脉冲离心促融去壁

[A-B+]〔高渗下〕[A-B+]融合子〔AA,BB,AB〕长成菌落[--]检出[A+B+]融合子筛选优良性状的融合子根据融合的目的选择适宜的直接亲本。现在一般认为亲本应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的杂种优势。作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记，便于重组体的检出。常用的遗传标记有：带隐性性状的营养缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标记。实际应用时究竟采用哪各遗传标记，可以根据试验目确实定。1、亲本及遗传标记的选择早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质，制备效果都不理想，目前人们主要运用酶法来制备原生质体。人们多倾向于使用复合酶进行处理，常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和几丁质酶等不同微生物在制备原生质体时所需酶和种类不同，而且所需酶量也存在着差异。适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素，酶浓度过大时，酶中往往含有对原生质体有害的酶类(如过氧化物酶、核糖核酸酶等)，随着酶量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当到达一定浓度时，必然会影响原生质体的活性；酶浓度过大，易使菌体凝集，难于原生质体化；而且，细胞脱壁太彻底，必然降低原生质体的再生率。2、原生质体制备菌龄：在菌龄的选择上，多采用对数生长期或生长中后期的菌，这是因为，菌体的不同生理状态直接影响到细胞壁的结构，对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感，但是对数生长早期的菌相对较为脆弱，受酶的过度作用会影响原生质体的再生率。酶解时间在原生质体制备过程中也是一个非常重要的因素。原生质体制备液的pH值，也可以直接影响到原生质体的制备。因为只有在最适pH值时，酶的活性才最高，酶促反响速率才最大影响原生质体形成的因素：渗透压稳定剂：由于原生质体对渗透压非常敏感，渗透压稳定剂对于原生质体的制备起着重要作用。常用的渗透压稳定剂有KCl,NaCl,CaCl2,MgSO4，等无机盐和蔗糖、甘露糖、山梨醇等，一般说来，丝状真菌以无机盐作为稳定剂比较适宜，而酵母菌那么使用糖或醇做稳定剂比较好。原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生。不同微生物的原生质体最适再生条件存在一定的差异培养基：在再生培养基中会添加一些营养物质这些物质可能是作为细胞壁合成的前体物质也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢加速细胞壁合成的作用。菌龄：菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全，营养供给缺乏再生能力也较低；菌龄长的原生质体再生率高。Ca2+：Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。3、原生质体再生原生质体悬浮液未酶解的细菌无菌水稀释高渗溶液稀释高渗溶液稀释培养培养培养计数再生率〔%〕=再生培养基上总菌落数—酶处理后未原生质体化菌落数原生质体数×100%总菌落数(A)未原生质化细胞〔B)再生菌落(C)=C－BA－B×100%再生率及其计算

所谓原生质体融合，就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加人物理的或者化学的或者生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，而后发生基因组间的交换重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来，从而获得重组子的过程。4、原生质体融合PEG融合法原生质体融合的影响因素PEG浓度：PEG既是促融剂又是渗透压稳定剂，低浓度低分子量的PEG促融效果不好，也容易导致原生质体破裂。但是高浓度的PEG会导致原生质体收缩，降低融合频率，而且过高浓度的PEG对原生质体有毒害作用。一般为30-40%。促融时间：促融时间增加可以使原生质体融合时机增多，但是，PEG对原生质体有毒，为保证原生质体的再生能力，促融时间不宜过长。无机离子：原生质体融合过程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促进融合，而K+、Na+会显著降低融合率，融合时一般Ca2+0.01mol/L、Mg2+0.02mol/L为佳。各菌种间略有差异。融合体中除重组体外，还有异核体或局部结合子、杂合二倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物的不同加以选择。利用营养缺陷型标记选择融合体利用抗药性选择融合体利用灭活原生质体检出融合体利用荧光染色法选择融合体双亲对碳源利用不同而检出融合体利用形态差异检出5、融合体的检出与别离这是一种传统而有效的选择方法，其检出原那么是：融合的双亲带有不同的营养缺陷型标记，在别离培养基上只有融合体生长而不能让双亲形成的原生质体形成菌落。其原理是因为缺陷型的双亲由于丧失了合成某种物质的能力，它们在基体培养基上不能生长、繁殖，局部单亲原生质体的同源融合体也不能在基体培养基上形成菌落，只有双亲原生质体的融合体因营养物质互补而形成菌落。利用营养缺陷型标记选择融合体

荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光色素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取现时带有双亲原生质体荧光标记的融合体，直接别离到再生培养基上再生，最后得到融合体。具体方法：制备原生质体时，在酶解液中参加荧光色素，使双亲分别携带有不同的荧光标记。它对原生质体活力无影响，携带色素的原生质体能正常进行融合并具有再生能力。使用这种方法时，两种荧光染料的区分要明显，并注意染料的浓度和处理时间。利用荧光染色法选择融合体融合原生质体悬浮液稀释完全再生培养基选择性再生培养基培养培养重组体×100%融合率（%）=选择性培养基上再生的菌落数完全培养基上再生的菌落数从野生型或突变型菌株中选择两亲本收集菌体，酶解，获取原生质体以107—108ml-1

的浓度混合参加30%—40%PEG及适量的CaCl2、MgCl2维持在一定pH值的渗透压稳定剂中，适温处理1—10min再生培养基稀释4—5倍低速离心数分钟除去上清液，收集沉淀物0.1mol/LCaCl2洗涤两次用融合液悬浮制备的融合体三、原生质体融合的应用提高产量或质量，合成新物质改进菌种遗传物性优化菌种发酵物性质粒转移原生质体与细胞核融合进行遗传分析细胞〔＋〕细胞〔－〕有性接合染色体重组新遗传型能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交Saccharomycescerevisiae的杂交育种过程：将甲亲本与乙亲本菌株〔双倍体〕分别接种到含醋酸钠等产孢子培养基斜面上，用蒸馏水洗下子囊，机械法破坏子囊获得子囊孢子，将子囊孢子铺平板获得单倍体细胞组成的菌落，通过离心等方法使单倍体细胞密集接触，即有时机产生双倍体的有性杂交后代。S.Cerevisiae的双倍体和单倍体细胞的比较项目双倍体单倍体细胞菌落液体培养产孢子培养基上大，椭圆形大，形态均一繁殖较快，细胞较分散形成子囊小，球形小，形态变化较多繁殖较慢，细胞常聚集成团不形成子囊在半知菌类中最为常见六、准性生殖〔parasexualhybridization〕菌丝联结形成异核体核融合体细胞交换和单倍体化准性生殖过程Penicilliumurticae的准性生殖育种过程选择亲本：〔用营养缺陷型作为遗传标记〕强制异合：〔用根本培养基筛选形成异核体的细胞和杂合二倍体细胞〕移单菌落：〔将在根本培养基上生长的单菌落移种到根本培养基斜面上〕选择重组体：〔采用各种选择培养基选择不同的融合子〕

准性杂交育种第五节基因突变与微生物育种一、基因突变基因突变〔genemutation〕简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在10-8~10-9范围内。(一)基因突变的类型〔根据遗传信息的变化〕

原序列5‘-AUGCCUUCAAGAUGUGGGMetProSerArgCysGly(1)同义突变5‘-AUGCCUUCAAGAUGUGGAMetProSerArgCysGly(2)错义突变5‘-AUGCCUUCAGGAUGUGGAMetProSerGlyCysGly(3)无义突变5‘-AUGCCUUCAAGAUGAGGAMetProSerArg(4)移码突变5‘-AUGCCUUCAAGU

GUGGGMetProSerSerVal突变类型突变株的表型 成因 检出方法营养缺陷型因突变而丧失合成一 补充培养基〔auxotroph〕种或几种生长因子的 能力不能在根本培养 基上生长突变株抗性突变型因突变而产生了对某 药物培养基〔resistantmutant〕种化学药物或致死 物理因子的抗性条件致死突变型突变后在某种条件下培养条件改变〔conditional可正常生长、繁殖并lethalmutant〕实现其表型，而在另 一条件下却无法生长 繁殖的突变型突变株的表型 成因检出方法形态突变型因突变而产生的个体 形态或菌落形态的非选择常用颜色变性变异

抗原突变型因突变而引起的抗原借助于抗原结构发生改变抗体反响

产量突变型因突变而获得的在有测定产量或用代谢物产量上高于其它 原始菌株的突变株 其它突变型：毒力、糖发酵能力、代谢产物等 突变率突变率:每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率为10-8是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株〔mutant，即突变型〕的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2×108个细胞时，即可产生一个突变表型。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数突变率是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。一些菌种某些性状的自发突变率菌名突变性状突变率EscherichiacoliE.coliE.coliE.coliStaphylococcusaureusS.aureusSalmonellatyphiBacillusmegaterium抗T1噬菌体抗T3噬菌体不发酵乳糖抗紫外线抗青霉素抗链霉素抗25ug/L链霉素抗异烟肼3×10-81×10-71×10-101×10-51×10-71×10-95×10-65×10-5〔二〕突变的特点

适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。

1.不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。

〔变量试验、涂布试验、平板影印培养试验〕

2.自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。

3.稀有性：突变率低且稳定。

4.独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。

5.可诱发性：诱变剂可提高突变率。

6.稳定性：变异性状稳定可遗传。

7.可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向

突变〔forwardmutation〕，相反的过程那么

称为回复突变或回变〔backmutation或

reversemutation〕。

基因突变自发性和不对应性的实验证明三个经典实验变量实验涂布实验影印实验证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。野生型〔原始性状〕特定环境突变型〔适应环境的新性状〕驯化定向诱变筛选？？？突变的原因？1.变量实验〔fluctuationanalysis〕SalvadorLuriaandMaxDelbruck〔1943〕SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969变量实验〔fluctuationanalysis〕2.Newcombe的涂布实验〔1949〕3.影印实验〔replicaplating〕JoshuaLederbergandEstherLederberg〔1952〕JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958〔三〕基因突变的分子根底仅影响一对碱基影响一段染色体1.自发突变机制：无人为因素下的低频率突变原因：〔1〕背景辐射和环境因素〔2〕有害产物积累〔3〕互变异构效应〔4〕环出效应〔5〕移码突变〔6〕脱嘌呤或脱嘧啶〔7〕RNA基因组突变2.诱发突变：物理、化学核生物的因素，提高突变率的人为的作法〔1〕化学诱变剂碱基的置换引起的突变★直接引起置换的诱变剂亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。HNO2胞嘧啶〔C〕尿嘧啶〔U〕HNO2腺嘌呤〔A〕次黄嘌呤〔H〕HNO2鸟嘌呤〔G〕黄嘌呤〔X〕这些反响及形成物均可在DNA复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。碱基转换的分子机制——以亚硝酸为例腺嘌呤〔A〕变成次黄嘌呤〔H〕后引起的转换过程：①腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤〔He〕②He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤〔HK〕③DNA复制时，HK与胞嘧啶〔C〕配对④DNA第二次复制时，C与G正常配对，实现了转换。这类诱变剂主要是一些碱基类似物,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶〔5—AU〕、叠氮胸腺嘧啶〔AIT〕等等；作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中，主要是在DNA复制时碱基类似物插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。以5-溴尿嘧啶(5-BU)为例：5-BU是胸腺嘧啶〔T〕的的类似物，酮式的5-BU可以和A配对，烯醇式的5-BU可以和G配对，在DNA分子复制的过程中，由于5-BU的插入和互变异构导致碱基置换。★间接引起置换的诱变剂5-BU引起的转换移码突变：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误

错误+错误-+正常---正常+++正常在DNA复制过程中使链上增添或缺失一个碱基，引起移码突变。嘌呤－嘧啶对平面型三环分子结构相似嵌入两个相邻的DNA碱基对之间造成双螺旋的局部解开〔2〕物理诱变剂嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物，其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。

紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻胸腺嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的时机较少，但一旦形成，就会阻碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。染色体畸变〔chromosomalaberration〕某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤〔macrolesion〕——染色体畸变，它包括：染色体结构上的变化：缺失〔deletion〕重复〔duplication〕转座〔transpostion〕倒位〔inversion〕染色体数目的变化★染色体结构上的变化分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。染色体内畸变：只涉及一条染色体上的变化，如发生染色体的局部缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加；如发生倒位或转座时，那么可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。倒位--------是指断裂下来的一段染色体旋转180后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因顺序与其它的基因顺序相反；转座--------是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。染色体间畸变：指非同源染色体间的转座。重复、缺失、倒位、易位四、基因突变的修复光复活作用切除修复重组修复SOS修复光复活作用〔photoreactivation〕把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。光复活机理：经紫外线照射所形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗中与光激活酶〔photoreactivatingenzyme〕〔又称光裂合酶photolyase〕结合，形成的复合物暴露在可见光〔300~500nm〕下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。由于在一般的微生物中都存在着光复活作用，所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射及处理照射后的菌液。暗修复作用〔darkrepair〕暗修复作用又称切除修复〔excisionrepair〕，是细胞内的主要修复系统，用于修复被诱变剂〔包括紫外线、烷化剂、X射线和γ射线等〕损伤后的DNA的机制。全部修复过程由四种酶完成，即①内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5’一侧切开一个3’-OH和5’-P的单链缺口；②外切核酸酶从5’-P至3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；③DNA聚合酶修补缺口④连接酶连接裂口重组修复

一种越过损伤的修复机制，即通过交换，在嘧啶二聚体相应部位的子链上出现了缺口，该缺口由DNA聚合酶和连接酶修复。亲本链的嘧啶二聚体需切除修复SOS修复修复基因：lexA、recA、uvrA、uvrB、uvrC修复机理：lexA为调节基因，产生的阻遏蛋白在正常条件下与recA、uvrA、uvrB、uvrC的操作子结合，使细胞内仅合成少量的uvr蛋白〔修复蛋白〕，对自发突变产生的低水平的损伤进行修复。当细胞内产生大量嘧啶二聚体时，在复制过程中因不能得到修复而在子链上留下空隙和单链，少量的RecA蛋白立即与单链结合并激活其活性，RecA蛋白降解LexA阻遏蛋白，解除了对RecA蛋白和其他修复蛋白基因的抑制，对大量的二聚体进行切除修复。二、诱变育种自发突变与育种1、生产中育种10-6突变率-----寻找正向突变菌株2、定向培育优良菌种牛型结核杆菌------13年----230代----卡介苗〔减毒活菌疫苗〕诱变育种

诱变

+筛选诱变是随机的；筛选是定向的目前发酵工业生产菌株都是经过突变改造过的。〔一〕诱变育种的根本环节

〔二〕一般性原那么

1.选用优良的出发菌株

出发菌株—用来育种处理的起始菌株

◆出发菌株应具备

①对诱变剂的敏感性高；

②具有特定生产性状的能力或潜力；

◆出发菌株的来源

①自然界直接别离到的野生型菌株：

②历经生产考验的菌株：

③已经历屡次育种处理的菌株：2.制备单细胞或单孢子悬液

要求①菌体处于对数生长期，

②细胞分散且为单细胞，

方法：①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐温80

③用无菌脱脂棉过滤。

制备：物理诱变剂——生理盐水

化学诱变剂——缓冲液

浓度：细菌、放线菌108个/ml

霉菌、酵母菌106个/ml3.使用简便有效的诱变剂诱变剂物理因素化学因素紫外线激光离子束X射线r射线快中子艾姆斯试验测定潜在化学致癌物的根本原理艾姆斯试验测定潜在化学致癌物的根本原理Salmonellatyphimurium的组氨酸缺陷型〔his―〕菌株在[―]平板上不能生长，如发生回复突变那么能生长。如将可疑“三致〞物黄曲霉毒素，参加鼠肝匀浆，保温一段时间后，吸入滤纸片中，然后将滤纸片放置于[―]平板中央。经培养后，出现三种情况：如在平板上无大量菌落产生，说明试样中不含诱变剂；如在纸片周围有一抑制圈，其外才是大量菌落，说明试样中某诱变剂的浓度很高；如在纸片周围即生长大量菌落，说明诱变剂的浓度适宜。目前，艾姆斯试验法已广泛用于检测食品、饮料、药物核引水等试样中的致癌物。它具有快速〔仅3天左右〕、准确〔检测致癌物的符合率＞85%〕和费用省等优点。选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，那么应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂〞，如NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)。采用简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反响的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒〔也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片〕，经培养后，在制菌圈的边缘挑取假设干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板外表使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。4.诱变剂剂量的选择剂量=强度〔浓度〕×作用时间相对剂量=杀菌率用50—85%的杀菌剂量，此时正突变率高，特别是出发菌株已是高产菌株。诱变剂的剂量对产量变异影响的可能结果

a.未经诱变剂处理；b.变异幅度扩大，但正负突变相等；c.正突变占优势；d.负突变占优势

5.利用协同效应

诱变剂使用方式单一处理复合处理：诱变处理条件：温度〔生长温度〕PH〔缓冲剂〕处理时间诱变作用的终止：用解毒剂、用水稀释

第一轮：

一个出发菌株→→→

选出200个菌株→→→

选出50株→→→选出5株诱变处理初筛〔每瓶一株〕复筛〔每瓶四株〕

第二轮：

5个出发菌株→→→

→→

→

选出50株

→→

→选出5株40株40株40株40株40株诱变处理初筛复筛〔每瓶一株〕〔每瓶四株〕6.设计高效率筛选方案〔三〕几类突变株的筛选营养缺陷型(auxotroph)的筛选

抗药性突变株的筛选〔梯度平板法〕

产量突变株筛选

1.筛选营养缺陷型突变株根本培养基〔MM，minimalmedium〕：仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基，称根本培养基。可用符号“[－]〞来表示。完全培养基〔CM，completemedium〕：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的组合培养基，可称为完全培养基。可用符号“[＋]〞。补充培养基〔SM，supplementalmedium〕：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基，称为补充培养基。补充培养基的符号可根据参加的是A或B等代谢物而分别用[A]或[B]等来表示。

与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体野生型：从自然界别离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株。营养缺陷型：野生型菌株经诱变处理后，丧失了某酶的合成能力，只能在加有该酶合成产物的培养基中生长，这类突变称为营养缺陷型突变株〔简称营养缺陷型〕。原养型：营养缺陷型突变经回变或重组后产生的菌株，营养要求在表型上与野生型相同。营养缺陷型的筛选方法诱变剂处理淘汰野生型〔抗生素法、菌丝过滤法〕检出缺陷型〔夹层培养法、限量补充培养法、逐个检出法、影印接种法〕鉴定缺陷型〔生长谱法〕第二步：淘汰野生型〔浓缩缺陷型〕诱变后，仍存在大量的野生型，不利于别离〔1〕抗生素法野生型菌株在MM上生长+青霉素—杀死Ｇ＋缺陷型菌株在MM上不生长＋青霉素—-不杀死注意：使环境的渗透压提高，防止细胞破裂。抗生素处理完后，离心收集细胞，并转入低渗溶液制霉菌素法那么适合于真菌〔例如：酵母、霉菌〕，可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起溶菌〔2〕菌丝过滤法适于：丝状〔放线菌、霉菌〕原理：野生型根本培养基上发育成菌丝；缺陷型孢子不萌发可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。

第三步：检出缺陷型

逐个检出法

影印检出法夹层培养法

限量补给法

在含少量的〔0.01%〕蛋白胨的MM上培养,大菌落为野生型小菌落的为缺陷型。第四步：鉴定缺陷型生长谱法组合营养物法组合补充培养基法

生长谱法

斜面菌种-----生理盐水洗下细胞------洗涤-----涂布〔105个/皿〕抗药性突变株的应用：*作为菌株的遗传标记*作为生产菌种〔结构类似物抗性突变株〕如“吡哆醇高产菌株的筛选〞2.抗药性突变株的筛选〔梯度平板法〕

3.产量突变株筛选琼脂块培养法〔春日霉素〕孢子悬液------诱变----适当培养〔表型迟延〕-----

涂布平板----打孔取菌落-----琼脂块培养----4-5天—

测定琼脂块所含的抗生素的抑菌圈----效价高菌