基因探针分子杂交技术课件

基因探针

——分子杂交技术Molecularprobetechniques1目录简介基本原理分类历史及发展主要应用xx操作步骤Southern杂交Northern杂交Western杂交2xx基因探针基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。FISH3xx基因探针分析的基本原理两条不同来源的核酸单链如果在一定区段具有互补的碱基序列,或者说具有一定的同源性,就可以特异性结合,形成双链杂种分子,这种结合称为核酸分子杂交。如果用已知核酸(通常是DNA)片段作为探针,通过与未知核酸(DNA或RNA)样品进行杂交试验,根据两者杂交状况的分析,就可以确定它们同源性程度,检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。这便是核酸探针分析的基本原理。4xx分子杂交技术的分类根据其检测对象不同，可分为检测对象探针Southern杂交DNA核酸Northern杂交RNA核酸Western杂交蛋白质抗体根据探针来源的不同，可分为来源基因组探针（genomicprobe）基因组cDNA

探针（cDNAprobe）mRNA寡核苷酸探针（Oligonucleotides

Probe）人工合成5xx基本操作程序印迹（blotting）将样品在凝胶上分离，然后将样品通过“影印”的方式转移到固相支持物上（如滤膜）。杂交将已印迹有样品的滤膜与带有放射性标记或其它标记的探针进行杂交。结果检测通过放射自显影或显色反应，判断样品中是否有与探针同源的分子。6xxSouthern杂交检测样品DNA的处理电泳分离及变性处理转移并固定到滤膜上探针的制备及杂交检测与分析7xx检测样品DNA的处理提取检测样品的基因组DNA用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段8xx电泳分离及变性处理琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段变性处理通常DNA变性的方法：热变性、酸碱变性、化学试剂变性在0.4M

NaOH碱性条件下变性凝胶0.4MNaOH9xx转移并固定到滤膜上通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射将DNA固定在滤膜上。10xx转移的方法毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法11xx探针的制备一、探针的合成 PCR、化学合成等方法二、探针的标记 同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、荧光素等12地高辛：可以与dCTP连接成地高辛-dCTP

原理：

地高辛+

抗地高辛抗体（带有荧光素或酶的标记）1314xx杂交预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸在滤膜上。15xx

洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。精确控制杂交及洗涤条件（如温度及盐浓度），在同源序列中即使有一对碱基错配也可检出。这技术已应用于遗传病（基因病）的临床诊断。安装杂交管杂交炉16xx检测与分析1、放射自显影：适用于放射性同位素标记的探针2、比色或化学发光检测：适于非同位素标记的探针通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其分子量。

17xxNorthern杂交1、检测对象为RNA。2、与Southern杂交不同的是：1）不需要限制性核酸酶切；2）变性方法不是碱变性，而是采用化学试剂变性法。3、主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。18xxWestern杂交1、基本原理和基本过程与Southern杂交基本相同2、检测对象为蛋白质（或酶）3、SDS电泳分离4、用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。19历史及发展1969年，Gall和Pardue（YaleUniversity）等首次将同位素探针用于原位杂交实验，获得成功。1987年，染色体原位抑制杂交法的创建，使FISH技术得以迅速发展。随后，Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素等非放射性物质标记探针，创立了双色FISH技术。1990年，Nederlof

等用3种荧光素成功探测出了3种以上的靶位DNA序列，从而宣告了多色FISH技术的问世。Southern印迹杂交（Southernblot）是1975年由英国爱丁堡大学的E.M.Southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（GeorgeStark）。在尼尔·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析生物化学》（AnalyticalBiochemistry）中首次被称为WesternBlot。发展：基因芯片技术、生物传感器等。xx20xx分子杂交技术的主要应用

1.基因工程和分子生物学研究

2.检测病原微生物及寄生虫3.普查和诊断遗传性疾病

4.法医物证学

21xx基因工程和分子生物学研究作为生物技术核心的基因工程(重组DNA技术)是

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0年代兴起的、按人们意愿定向改造生物遗传性状的技术。 其主要步骤是取得目的DNA,与载体DNA体外重组,将重组DNA分子导入宿主细胞,筛选能够表达重组DNA的细胞加以传代扩增。这中间筛选步骤,就可以用DNA探针进行菌落或噬菌体原位杂交来完成。22xx基因工程和分子生物学研究分子生物学研究中凡涉及核酸的定位、定量及序列分析等方面的工作,诸如染色体基因定位,基因突变及不同种属间基因变异的研究,细胞

中DNA的转录过程的研究,以及探讨病毒、肿瘤基因和细胞癌变之间可能存在的关系等,都需要应用分子探针技术。23xx检测病原微生物及寄生虫对于人体或环境中存在的细菌、病毒微生物,现行检测方法既费时又不够准确。如果用特异的DNA探针检测微生物包含的核酸片段,不但灵敏快速,而且特异性强,甚至可以分析同种异株间的区别。DNA探针推广至微生物检验上,对于诊断传染病、开展流行病学研究将有重要意义。24xx检测病原微生物及寄生虫 乙型肝炎是危害我国人民健康的大敌,现在已开发DNA探针法检测乙肝病毒DNA的技术,比现行的免疫学检验结果更灵敏可靠,是普查乙肝传染的强有力手段,该技术正在国内普及推广。 此外,DNA探针还可以应用于对利什曼原虫病、疟原虫病等寄生虫感染疾病的诊断。

25xx普查和诊断遗传性疾病 人类和动物的遗传性疾病是由于基因DNA的缺陷经遗传引起的。目前已知的三千多种遗传性疾病中,只有很少一部分可以通过检测基因的表达产物(蛋白质或酶)的改变予以诊断。用DNA探针可以在DNA水平分析基因结构的缺陷,突破依靠基因的蛋白产物进行诊断的局限。26xx普查和诊断遗传性疾病对于因为基因内点突变或基因部分缺失、重排或插入而引起的遗传性疾病,可以用DNA探针进行Southern印渍杂交直接加以分析诊断。对于那些尚不明其原发的基因缺陷的遗传性疾病,则需要用DNA探针技术分析限制性片段长度多态性,以此作为遗传标志作出分析诊断。总之,DNA探针技术有助于开展产前诊断或遗传咨询、携带者普查,为防治遗传性疾病开辟了新路。27xx法医物证学人类染色体中存在许多分散的具有串联重复单位的微小卫星区。利用人体卫星区DNA作探针检测不同个体的卫星区,产生相应的

DNA指纹图谱