细胞与细胞工程

Cell&CellEngineeringSchoolofLifeSciences,XiamenUniversityDr.GaoliangOuyang(欧阳高亮)Dr.ShuyongLin(林舒勇)2012-2013年第2学期生命科学导论安排讲座号题目任课教师第一讲细胞与细胞工程欧阳高亮，林舒勇第二讲基因与基因工程徐虹，顾颖第三讲微生物与传染性疾病陈毅歆，陈航姿，王彦海第四讲营养与健康金利华，周克夫第五讲人类遗传学与优生许晔，李光第六讲生物多样性与环境保护郑文教，杨盛昌第七讲生物技术在农业和医学领域的应用吴婷，程喆第八讲生物伦理与社会决策张赛群，陈长平课程召集人：罗大民Fertilizedeggcanbedevelopedintoembryoandusedtoisolateembryonicstemcells生命科学研究的范畴和层次核心领域：生物学〔动物学，植物学等〕，生物医学科学〔疾病相关研究〕小分子-生物大分子-细胞器-细胞-组织-器官-生物个体-群落-生态系统Science,Dec.2012Science2012年度十大科学进展心肌细胞肝细胞胰腺细胞……精子卵子胚胎干细胞饮食对肠道微生物组产生的作用，以及它们对患病风险的影响癌症免疫学研究黑色素瘤治疗方案〔dabrafenib〔BRAF抑制剂〕和trametinib〔MEK抑制剂〕组合药物〕干细胞试验的根底研究和临床研究单细胞测序技术人类连接组工程(HumanConnectomeProject)方案植物学根底研究——调控植物生长的分子遗传学机制Science和Nature2013年度生命科学领域热点预测Nature杂志那么指出今年干细胞试验的根底研究和临床研究也许会取得新进展，其编辑认为一项利用人类胚胎干细胞〔hESC〕进行的早期临床试验应该在2013年会获得具有里程碑意义的研究结果，这个由著名的先进细胞技术公司进行的实验，正在将源自hESC的视网膜细胞注入36名患有两种形式的无法治愈的退行性失明的患者眼中。这是目前唯一一家获得美国食品与药物管理局〔FDA〕批准开展hESC治疗试验的公司，并且先进细胞技术公司希望FDA能够为其开绿灯，从而于今年在病人中对诱导自成熟细胞的干细胞进行测试。细胞工程细胞工程是运用细胞分子生物学理论与技术，定向改造细胞乃至生物。用这种技术可以对细胞进行操作，到达定向改造生物的目的,是人们根据科学设计改变细胞的遗传根底，通过无菌操作，大量培养所需细胞，诱导形成组织甚至发育为完整个体的技术。迄今为止，人们已经从基因水平、细胞器水平以及细胞水平开展了多层次的大量工作，在细胞培养、细胞融合、细胞代谢物的生产和生物克隆等诸多领域取得一系列令人瞩目的成果，其中代表细胞水平的细胞工程研究也显示其巨大的应用前景。第一节细胞的特征细胞的根底知识细胞的生长、分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程第一节细胞的特征细胞是生命的结构和功能的根本单位。细胞是生命活动的根本单位。单细胞生物，一个细胞就是一个个体，而多细胞生物那么由许多细胞成一个个体。我们所看到的生物体都是由多细胞所组成。在多细胞生物体中，由形态结构相似的细胞再组成组织，执行着生物体中的局部功能。第一节细胞的特征细胞的根底知识细胞的生长、分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程根据细胞的内部结构，可将生物界的细胞分为两大类：原核细胞〔prokaryotes〕和真核细胞〔eukaryotes〕细菌、蓝藻和放线菌等由原核细胞构成的有机体称为原核生物，几乎所有的原核生物都由单个原核细胞构成。由真核细胞构成的有机体那么称为真核生物，真核细胞大多存在于多细胞生物中。单细胞生物与多细胞生物在适应环境等方面各有千秋.〔一〕细胞分类一.细胞的根底知识〔二〕细胞的大小和形态支原体〔mycoplasma〕巨型乌贼神经细胞〔nervecell〕蕨藻〔caulerpa〕细胞形态的多样性硅藻草履虫无论各种细胞的大小和形态有多大的差异，它们都由一层具有一定生物学功能的细胞膜包裹在细胞外层。由于这层细胞膜将细胞内部和外部环境分隔开，使细胞内部的各种生命活动发生在特定的环境中保障了单细胞个体的生命活动和多细胞个体中不同功能细胞的相对独立性，使其成为生物体的功能单位。〔三〕细胞的结构结构简单，因而相对较小没有细胞核和大多数细胞器〔恒定的内膜系统)细菌和古细菌两类三个结构区域：鞭毛或纤毛，胞外被膜和细胞质I.原核细胞Prokaryoticcells三大结构体系：生物膜系统：质膜、内膜系统〔细胞器〕遗传信息表达系统：染色质(体)、核糖体、mRNA、tRNA等细胞骨架系统：胞质骨架、核骨架II.真核细胞〔eukaryoticcells〕chromatid具有核膜和由膜围成的各种细胞器，如内质网、高尔基体、线粒体、叶绿体、溶酶体等。内膜系统将细胞质分隔成不同的区域，即所谓的区隔化(compartmentalization)。区隔化使细胞内外表积增加了数十倍，代谢能力增强。第一节细胞的特征细胞的根底知识细胞的生长、分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程G0期:休眠期G1期:DNA合成前期S期:DNA合成期G2期:

DNA合成后期M期:有丝分裂期〔一〕细胞增殖二.细胞的功能～20h细胞分裂三种方式

(二)细胞分化多细胞生物体是由各种各样形态和功能都不同的细胞群所组成。高等动、植物由受精卵细胞开始的胚胎发生过程随着细胞分裂次数的增加而使得早期胚胎的细胞数量也增加许多。其中有些细胞在形态、结构和功能上逐渐发生了差异，这种细胞之间差异的发生过程就是细胞分化。个体发育的过程就是细胞分化的过程，个体的各种器官和组织都是通过细胞分化形成的。

囊胚原肠胚Examplesofnamesandtypesofcelldeath.(A–I)Electronmicroscopy;(J–L)phasecontrast.(A)NormalHeLacells;(B)treatedwithstaurosporintoinduceapoptosis;or(C)treatedwiththapsigargintoinduceautophagy(Galluzzietal,2007).(D)Apoptotic,and(E)necroptoticJurkatcells(Degterevetal,2005).(F)Paraptotic293Tcells(Sperandioetal,2000;copyright(2000)NationalAcademyofSciences,USA).(G)Necroticand(H)autophagiciBMKcells(Degenhardtetal,2006;Mathewetal,2007).(I)Ras-expressingU251glioblastomacellsshowingmacropinosomes(J.H.Overmeyer,A.Kaul,E.E.Johnson&W.A.Maltese,unpublisheddata).(J)Dictyosteliumcells,vegetative,(K)undergoingvacuolarautophagiccelldeath,and(L)undergoingnecroticcelldeath(Laporteetal,2007).

凋亡自吞噬凋亡坏死自吞噬坏死凋亡〔apoptosis，程序性死亡〕，坏死〔necrosis〕，自吞噬〔autophagy〕，衰老〔senescence〕…

(三)细胞衰老和死亡Hayflick'sLimit:humancellsderivedfromembryonictissuescanonlydivideafinitenumberoftimes(~50)incultureFibroblastDivision20times50times细胞衰老LimitlessReplicativePotential

Humansomaticcellshaveafinitereplicativepotential,oncecellsprogressedthroughacertainnumberofdoublings,cellswillstopgrowing------aprocesstermedsenescence.LossofproliferativecapacitywithageApoptosisandnormalmorphogenesis(Mousepaw)细胞死亡控制失效的后果：该死的不死：肿瘤不该死的死了：退行性疾病〔AD，Parkinson’sDisease〕TumorsasComplexTissuesThetumormicroenvironmentisregulatednotonlybycancercellsbutalsobyendothelialcells,immunecellsandstromalelements

------HanahanD,WeinbergRA.Cell,2000.

(四)肿瘤CellcyclecheckpointTumorinvasion-metastasiscascade〔肿瘤侵袭转移〕CancersResultFromgeneticMutation

Alterationinthecell'sDNAsequence

Epigeneticchange:achangeinthepatternofgeneexpressionwithoutachangeintheDNAsequence

ChemicalcarcinogensIonizingradiationsViruses

Agentsthatgiverisetocancer

Many,butnotall,cancer-causingagentsdamageDNA

FungaltoxinaflatoxinB1ThemorepotentonesarerelativelyinertchemicallyandbecomedamagingonlyaftertheyhavebeenchangedtoamorereactiveformbymetabolicprocessesMetabolicactivationofacarcinogenZhouBB,etal.NatRevDrugDiscov.2009.Cancerstemcells(CSCs),alsoknownastumorinitiatingcellsortumorigeniccells,refertoasmallsubsetoftumorcellsthathavestem-likecellproperties,theabilitytoself-renew,differentiateintoheterogeneouspopulationsofcancercells,andseednewtumorsinaxenotransplantsystem.Cancerstemcell(肿瘤干细胞〕第一节细胞的特征细胞的根底知识细胞的生长、分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程体外培养细胞的根本类型形态：成纤维样细胞和上皮样细胞根据细胞能否在支持物上生长，分为贴附型和悬浮型。成纤维样细胞上皮样细胞悬浮型细胞第二节动物细胞工程一、动物细胞培养细胞培养的根本设备无菌室无菌操作台二氧化碳培养箱倒置显微镜细胞计数仪透射电子显微镜激光扫描共聚焦显微镜培养瓶培养皿培养板培养液第一节细胞的特征细胞的根底知识细胞的生长、分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程二.单克隆抗体

1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。单克隆抗体的应用分子细胞生物学根底研究疾病的定向治疗〔肿瘤免疫疗法，风湿性关节炎等〕疾病的早期诊断超过150亿美元的市场第一节细胞的特征细胞的根底知识细胞的生长、分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程三.动物克隆生物学上，克隆指的是低等生物无性繁殖产生遗传信息完全一致的群体的自然存在的过程。生物技术领域，克隆指的是复制〔拷贝〕DNA片段〔分子克隆〕，细胞〔细胞克隆，应用于干细胞〕乃至生物体〔生殖克隆〕的手段。生殖克隆一般指创造遗传特性上完全一致的多细胞个体的过程，是一种无性繁殖。人为创造：体细胞核移植，利用显微外科技术，将一个体细胞核移植到一个去核的卵细胞中，再植入母体子宫，便可不经授精而发育。胚胎分裂〔胚胎孪生〕自然存在：个别雌性昆虫，甲壳类和蜥蜴成熟个体的复制克隆研究的历史及现状Hansspemann,1869-19411928年进行了首次核移植实验1935年获诺贝尔生理医学奖1938年预言了克隆高级生物的可能性德国胚胎生物学家〔thefatherofcloning〕HansSpemann的蝾螈核移植实验

1938年Spemann和他的学生发现，把发育早期的蝾螈细胞核移植到去除了细胞核的发育晚期蝾螈胚胎中，胚胎细胞可以继续发育成为一个完整的蝾螈。1952年Briggs和King用囊胚细胞核克隆了蝌蚪RobertBriggs(1911-1983)ThomasKing

(1921-2000).紫外线照射未受精卵移核卵蝌蚪197移核卵，104个分裂发育，35各发育为胚胎，27个成为蝌蚪Thefirstclonedvertebrate囊胚细胞——分化早期的胚胎细胞1962年JohnGurdon用肠细胞〔分化终末细胞〕核克隆青蛙JohnGurdon(1933-)紫外线照射未受精卵移核卵蝌蚪提取肠上皮细胞核注入细胞核蝌蚪囊胚囊胚不分裂畸形胚成蛙细胞可以“重编程〞克隆技术的根底1979年KarlIllmensee宣布运用核移植法成功克隆了3只小鼠，但该结果没有得到科学界公认1986年丹麦科学家SteenWilladsen

成功利用胚胎细胞克隆出一头绵羊，这是首次证实的通过核移植技术克隆哺乳动物哺乳动物的克隆1995年7月

苏格兰Roslin研究所的IanWilmut和KeithCampbell运用早期分化的胚胎细胞克隆出了两头绵羊，命名为Megan和Morag,这被看作是多莉诞生的前奏1996年7月5日第一个用成年体乳腺细胞克隆产生的哺乳动物——绵羊多莉〔Dolly〕诞生July5,1996~February14,2003多莉（Dolly）RoyalMuseuminEdinburghWilmut,A.E.Schnieke,J.McWhir,A.J.KindandK.H.Campbell.Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammaliancells.Nature,1997,385:810–813.克隆羊多莉引发的动物克隆热牛，05/07/1998,日本猴，14/01/2001,美国猫，14/02/2002,美国骡，29/05/2003,美国小鼠，05/12/1999,美国骆驼，8/04/2009,阿联酋(1)遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对动物(人)生长、发育、衰老和健康等机理的研究；(2)有利于大量培养品质优良的家畜;(3)经转基因的克隆哺乳动物，将能为人类提供源源不断的廉价的药品、保健品以及较易被人体接受的移植器官；(4)科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆,即借腹怀胎的新领域,这无疑将大大促进对濒临灭种的哺乳动物的保护工作。克隆技术将对21世纪产生的重大影响〔？？？〕第一节细胞的特征细胞的根底知识细胞的生长、分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程Stemcellsarepowerfultoolsinbiologyandmedicine.Whatcanscientistsdowiththesecellstoexploittheirincrediblepotential?Adaptedfrom

PrinciplesofBiology

publishedby

NatureEducation.

JAMESKING-HOLMES/SCIENCEPHOTOLIBRARYAmouseembryoisheldinplaceduringnucleartransfer.Theegg'sgeneticmaterialhasbeenremovedandanadultcellnucleusisinjectedinitsplace.四.干细胞工程Pluripotent:cantransformintoanyoneofthe220celltypesinthehumanbody.

Self-renewal:onestemcellcanalsodividetoproducemillionsmorestemcells.1.WhatareStemCells?innearlyallanimals,fromtinywormstomiceandhumans.embryonicstemcellsadultstemcellsinducedpluripotentstem(iPS)cells2.TypesofStemCellsEmbyonicStemCellsVS.AdultStemCellsStemCells:FlexiblefriendsNature

483,

S22–S26Inthepastdecade,scientistshavealsolearnedtomakestemcellsfromregularmature,differentiatedcells.Thesecellsarecalledinducedpluripotentstemcellsbecausescientistsforcethemtobecomepluripotentevenaftertheyhavereachedadifferentiatedstate.

Byturninguptheexpressionofjustafewgenes,scientistscanforceaskincell,forexample,toretraceitsdevelopmentalpathwaybackwardsallthewaytoaflexiblepluripotentstate.

InducedPluripotentStemCells3.MedicalApplicationsStemcellscanteachusaboutthebiologyofpluripotentcells,howthehumanbodydevelops,andwhathappensduringdisease.Theyarealsoatoolfordevelopingsaferwaystodesignandtestnewmedications.theyarethebasisforregenerativemedicine,usingstemcellstorepairdamagedtissue.

……ThediscoveriesofGurdonandYamanakahaveshownthatspecialisedcellscanturnbackthedevelopmentalclockundercertaincircumstances.Althoughtheirgenomeundergoesmodificationsduringdevelopment,thesemodificationsarenotirreversible.Wehaveobtainedanewviewofthedevelopmentofcellsandorganisms.ResearchduringrecentyearshasshownthatiPScellscangiverisetoallthedifferentcelltypesofthebody.Thesediscoverieshavealsoprovidednewtoolsforscientistsaroundtheworldandledtoremarkableprogressinmanyareasofmedicine.iPScellscanalsobepreparedfromhumancells.Forinstance,skincellscanbeobtainedfrompatientswithvariousdiseases,reprogrammed,andexaminedinthelaboratorytodeterminehowtheydifferfromcellsofhealthyindividuals.Suchcellsconstituteinvaluabletoolsforunderstandingdiseasemechanismsandsoprovidenewopportunitiestodevelopmedicaltherapies.Fromsurprisingdiscoverytomedicaluse皮肤细胞iPS神经细胞心肌细胞肝细胞精子、卵子Whyisatherapeuticcloningapproachimportant?Bygrowingnewbodypartsfromexistingonesfromthesamepersonwecanavoidtransplantrejectionproblems.Byusingcellsre-engineeredor“cloned〞fromourselveswecanbecomeourowntransplantsource-similartobankingbloodforourselvesbeforeasurgicaloperation.PeopleintheUSaffectedbydiseasesthatmaybehelpedbystemcellresearchCondition NumberofPersonsAffectedCardiovasculardiseases 58MillionAutoimmunediseases 30MillionDiabetes 16MillionOsteoporosis 10MillionCancer 8.2MillionAlzheimer'sdisease 4MillionParkinson'sdisease 1.5MillionBurns(severe) 0.3MillionSpinalcordinjuries 0.25MillionBirthdefects 150,000(peryear)Total 128.4Million--------------------------------------------------------------------------------------DatafromthePatients'CoalitionforUrgentResearch,Washington,DC(accordingtoPerry,Ref.267).NATURE

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NEWSChina’sstem-cellrulesgounheededHealthministry’sattemptatregulationhashadlittleeffect.Nature

484,

149–150

(12April2012)It’sboomtimeforfirmssellingstem-celltreatments,suchasthosederivedfromumbilicalblood.LIUHAIFENG/XINHUAPRESS/CORBISNATURE

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NEWSStem-celltherapytakesoffinTexasAboominunprovenproceduresisworryingscientists.Nature

483,

13–14

(01March2012)

Celltexhoststhelargeststem-cellbankintheUnitedStates.TYLERRUDICK4.DevelopmentoftheStemCelltechniqueWherearetheStemCells?自然胚胎克隆人胚胎-核移植/混种胚胎-核移植体细胞诱导多能干细胞(体细胞转分化)In1868,GermanbiologistErnstHaeckelfirstusedtheterm'stemcell'todescribeazygote.Researchershavebeenworkingwithmouseembryonicstemcellssince1981.thefieldtookoffin1998,whenresearchersisolatedhumanembryonicstemcellsforthefirsttime.〔最早的人类多能干细胞是从体外受精的临床病例中得来的多余胚泡。这个里程碑式的事件是JamesThomson领导的UniversityofWisconsin,Madison的实验室在1998年的成果。〕3.1IsolationandcultureofStemCells3.2ObjectionstoStemCellReasearch2008纽卡斯尔大学将从人类皮肤细胞中提取的DNA注入来自母牛卵巢的卵子，卵子的所有遗传物质根本上都被去除。3.3InterspeciesEmbryos2003上海第二医科大学盛慧珍教授研究组将人的体细胞核植入去核的兔卵细胞中。3.4AdultStemCellsdonotraisetheethicalquestionsthatembryonicstemcellsdobecausenoembryosareneeded

existinvery

smallnumbers

oftenburieddeepinthetissue

mainlyusedfortwotreatments:bone-marrowtransplantstorebuildapatient'simmunesystem,andskingraftstoreplaceskinoveraburnorotherinjuryotherapplicationsforadultstemcells？usedrugstoactivateapatient‘sownadultstemcellstoperformthenecessaryrepairs？

Foralongtime,scientiststhoughtthatonceacelldifferentiated,itcouldneverregainitspluripotency.Theyassumedthatitmustbesetinitsidentitybecauseithadsomanygenesturnedonandoffinwaysparticulartothatcelltype.In2006,however,KazutoshiTakahashiandShinyaYamanakaofKyotoUniversityinJapanprovedotherwise.Theyturnedmouseskincells—specifically,fibroblasts—intostemcells.Thesewerethefirstinducedpluripotentstem(iPS)cells.

3.5InducedPluripotentStemCells

Thefirstdirectreprogrammingofadulthumanfibroblasts.IanWilmutScottishCentreforRegenerativeMedicine,UniversityofEdinburghIn2007issuesofCellandScience,Yamanakaandcolleagues(Takahashietal.,2007)andYuandcolleagues(Yuetal.,2007)demonstratethatexpressionoffourspecifictranscriptionfactorsgivesadulthumanfibroblastsmanyofthecharacteristicsofhumanembryonicstemcells.Refinement