粗糙链孢霉有性杂交的四分子分析

粗糙链孢霉有性杂交的四分子分析一、相关理论知识二、目的要求三、实验原理四、试剂与器材五、实验步骤六、实验结果七、本卷须知八、思考题吉林大学生物根底实验教学中心相关理论知识(1)链孢霉俗称红霉菌。链孢霉菌丝生长疏松，呈棉絮状，白色，分生孢子成串悬挂在气生菌丝上，呈桔红色，链孢霉广泛分布于自然界土壤中和禾木科植物上，分生孢子在空气中飘浮，靠气流传播，是高温季节发生的最重要的杂菌。7-9月是盛发顶峰。在20-30℃条件下，遇适合的栽培料，蔓延迅速，传播力强，菌丝生长阶段一旦发现菌袋上感染链孢霉，三天后整个生产场地都布满了链孢霉的孢子，有时会造成消灭性危害。防止链孢霉蔓延的最简单方法是发生部位涂上煤油柴油等可控制其危害。链孢霉有两种繁殖方式，一种是无性繁殖，当其孢子〔N〕或菌丝落在营养物上，孢子萌发，菌丝生长形成菌丝体〔N〕。另一种是有性繁殖，两个亲本必须是不同的交配型〔matigtype〕A和a，各自的分生孢子会散落在不同交配型子实体的受精丝上，进入子实体，进行核融合，形成2n核，〔A/a〕。二倍体时期十分短暂，很快进行减数分裂，最后再经过一次有丝分裂，在子囊中产生8个单倍体的子囊孢子，子囊孢子成熟后有可萌发，长成新的菌丝体。

相关理论知识(2)相关理论知识(3)链孢霉后代多，样本大，统计分析的误差小，生活周期段短，在短时间内可获得结果。链孢霉易培养和操作，可利用选择培养基筛选各种突变型；链孢霉又属真核生物，可作为真核的研究模型，因此是很好的遗传学实验材料。子囊孢子是单倍体，不存在显隐性的问题，表型和基因型一致；孢子按顺序排列在子囊中，我们称其为顺序四分子〔Orderedtetrad〕，经过分析易于确定是否是重组类型及基因的转变，其着丝粒本身也可看作是一个位点来研究，因此在四分体时期进行遗传分析是很方便的，这种方法称为四分子分析〔terardanalysis〕。目的要求1、学习菌种活化法,杂交方法及培养基配制方法。2、了解顺序排列的四分子遗传分析方法。3、掌握有关基因与着丝粒距离的计算和作图。实验原理链孢霉〔Neurosporacrassa〕属真菌类，染色体为n倍，繁殖方式可以有营养体菌丝或分生孢子经有丝分裂直接发育成菌丝体，并产生大量的分生孢子。如果把两个不同品系链孢霉接种杂交培养基上，链孢霉又能进行有性生殖。在有性生殖时，菌丝体的顶端，分生孢子的基部先长出一个原子囊果，类似高等植物的性器官，原子囊果能接受来自不同品系菌丝体上的分生孢子，原来n倍的原子囊果就变成了2n的子囊果，这个2倍体的合子经过减数分裂形成4个子细胞，每个子细胞又经过一次有丝分裂，使原来的4个细胞变成8个细胞，这8个细胞进一步发育成8个子囊孢子排列在一个子囊中，它们是一次减数分裂的产物。实验原理有性杂交是在形状不同的两个品系中进行的，子囊孢子的颜色有黑有白，通过杂交产生的8个子囊孢子应该是4黑4白，但排列的方式有不同，这是由于染色体交换引起的。减数分裂同源染色体配对时，4条染色单体发生交换的概率相同，造成8个子囊孢子有4种排列方式，加上没有交换亲组合2种排列方式，8个子囊孢子一共有6种排列方式，这是显微镜下可以直接观察到的。把观察到的子囊数目进行整理，按以下公式计算：重组值=交换子囊数/子囊总数×100%×1/2得到的重组值就是该性状在染色体上距着粒之间的距离。试剂与器材1、材料：〔1〕野生型粗糙链孢霉，自身可以合成赖氨酸，用lys+表示。子囊孢子是黑色的。〔2〕赖氨酸缺陷型粗糙链孢霉，自身失去合成赖氨酸的能力，必须在培养基中添加赖氨酸才能生长，用lys-表示。子囊孢子是白色的。链孢霉染色体数n=7，是单倍体。没有同源染色体，也就没有基因的显隐性，染色体上基因控制的性状可以直接在子代中表现出来。另外链孢霉进行有性生殖，通过两个不同性状亲本之间的杂交，可以直接在显微镜下观察到染色体的别离交换现象。2、试剂：琼脂、蔗糖、赖氨酸、玉米粒、次氯酸钠、马铃薯3、器材：恒温培养箱、高压灭菌器、烧杯、量筒、天平、试管、滤纸片、载玻片、盖玻片、记号笔、玻璃棒、药匙实验步骤1、配制菌种活化培养基〔1〕根本培养基〔供lys+活化用〕，将土豆去皮洗净，切成0.5cm3小块，分别装入试管中，每个试管5—7块。2%的琼脂条和2%蔗糖煮沸溶解后分装在有土豆块的试管中，经121℃，高压灭菌15min后，制做斜面备用。〔2〕补充培养基〔供lys-活化用〕，在根本培养基中按5mg/100mL参加赖氨酸即为补充培养基，其它相同。实验步骤2、菌种活化：从冰箱中取出lys+和lys-菌种，在无菌条件下把lys+接在根本培养基上，把lys-接在补充培养基上。接种好的试管放在25℃条件下培养5—6天，直至试管中长出许多菌丝，并且有大量的分生孢子时，说明菌种已经活化好。菌种活化时间不要过长，否那么菌丝和分生孢子已经老化，影响杂交成功率。实验步骤3、配制杂交培养基：将玉米粒浸泡24h后洗净，，每支试管装3粒。将2%的琼脂条和2%蔗糖煮沸溶解后分装在有玉米粒的试管中，经121℃，高压灭菌15min后，制做斜面备用。实验步骤4、杂交：将活化好的菌种lys+和lys-同时接到杂交培养基上，接种菌丝体和分生孢子都可以。接种完以后，在培养基外表放一小块滤纸片，接种后的试管放在25℃恒温培养箱中二周左右便有黑色颗粒状子囊果出现，但还没有完全成熟，到三周左右，子囊果根本成熟，可以在显微镜下观察，观察的最正确时间是杂交后的23—25天这段时间内。实验步骤5、显微镜观察〔1〕先把长有子囊果的试管中参加少量无菌水充分摇动，把水倒入烧杯中加热煮沸，防止分生孢子飞扬。〔2〕用接种针挑选个大饱满的子囊果放在载玻片上，滴上一滴5%次氯酸钠溶液浸泡2min左右。次氯酸钠的作用是对子囊果壁起腐蚀作用，以便将子囊果压破。压片时用力不宜过大，因为一次分裂产生的8个子囊孢子顺序的排列在一个子囊中，观察时要以子囊为单位进行统计，假设用力过大，8个子囊孢子被压出子囊都分散开了，不利于观察。实验结果子囊类型观察数++++－－－－－－－－++++++－－++－－－－++－－++++－－－－++－－++++－－总计实验结果实验结果分析经过显微镜下的观察，子囊孢子的排列方式有以下6种：第一次分裂别离子囊〔亲本类型〕〔1〕++++－－－－〔2〕－－－－++++第二次分裂别离子囊〔重组类型〕〔3〕++－－++－－〔4〕－－++－－++〔5〕++－－－－++〔6〕－－++++－－产生〔1〕和〔2〕两种亲本类型，是因为没有染色体之间的交换。本卷须知1、培养菌种是要注意培养温度。2、杂交后