【课件】重组DNA技术的基本工具 2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具提取抗虫基因棉花细胞苏云金芽孢杆菌(有抗虫特征)

普通棉花

(无抗虫特征)与载体DNA拼接，导入(含抗虫基因)

棉花植株(有抗虫特征)培育抗虫棉的简要过程基因工程实例：基因工程的概念：

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。1.别名：2.原理：3.操作对象：4.操作水平：5.结果：重组DNA技术基因分子水平基因重组赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品1、不同生物的基因为什么能拼接？2、外源基因为什么能在受体细胞中表达？思考-讨论(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。相同的遗传信息在

不同的生物体内表达出相同的蛋白质。基因工程诞生的理论基础

“工欲善其事，必先利其器”。在培育转基因番木瓜时，既要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组DNA分子导入番木瓜体内，并使其表达。DNA分子极小，实现这些精确操作需要哪些“分子工具”呢？从社会中来

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。

DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？转基因番木瓜(左）与非转基因番木瓜(右）工具分子手术刀分子缝合针分子运输车限制性内切核酸酶：DNA连接酶：载体：准确切割DNA分子将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞培育转基因番木瓜“分子手术刀”准确切割DNA分子“分子缝合针”“分子运输车”将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”1.简称：限制酶2.来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。3.作用：

识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。4.作用部位：特定部位的磷酸二酯键ATCGTAGC5’3’5’3’磷酸二酯键5.识别序列：

大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’6.限制酶的命名：

用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌(Escherichiacoli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。7.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——_________和_______黏性末端平末端当限制酶在它识别序列的___________将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是__________；当限制酶在它识别序列的_________切开时，产生的是______；中轴线两侧黏性末端中轴线处平末端黏性末端黏性末端2024/1/22

实例1—EcoRⅠ限制酶：

识别序列为GAATTC，

切割部位为GA之间的磷酸二酯键。

实例2——SmaⅠ限制酶：

识别序列为CCCGGG

切割部位为CG之间的磷酸二酯键。形成黏性末端平末端形成平末端课堂练习：写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ____EcoRⅠ___HindⅢ___BglⅡ___GATCAATTAGCTGATC思考：你从中发现什么现象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。

所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：

切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰二、分子缝合针—DNA连接酶1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

GDNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶种类DNA聚合酶DNA连接酶不同点作用实质作用结果模板相同点催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子需要不需要①化学本质都是蛋白质②都是催化形成磷酸二酯键DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较2.分类：种类E·coli

DNA连接酶T4DNA连接酶来源功能特性相同点大肠杆菌T4噬菌体只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）恢复的都是磷酸二酯键三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.作用：将外源基因送入受体细胞2.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。种类用途不同点质粒、噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别3.作为载体需具备的条件（1）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。（2）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。（3）常有特殊的标记基因（如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等），便于重组DNA分子的筛选。利用标记基因进行筛选示例：4.最常用的运载体——质粒（1）质粒的化学本质：质粒是一种____的、结构简单的、独立于______________或_______________之外，并具有自我复制能力的____________分子裸露真核细胞细胞核原核细胞拟核DNA环状双链DNA（2）基因工程中使用质粒的特点：

在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过_________的；这些质粒上常有特殊的标记基因，便于__________________；人工改造重组DNA分子的筛选重组DNA分子…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG重组DNA分子1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对?如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。DNA的粗提取与鉴定1.实验原理：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等

不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA二、材料用具1.选材：注意：2.试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用三、方法步骤：取材、研磨过滤或离心取上清液预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鉴定

抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；1.取材、研磨：

称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL

研磨液，充分研磨研磨的目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中2.过滤或离心取上清液：

在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。

也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？可能含有核蛋白、多糖等杂质②低温放置几分钟的作用：3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA

在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；

或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。搅拌时应轻缓、并沿一个方向：减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定

取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。实验组对照组水浴加热结果分析与评价1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？

观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯