大蒜及其制品中蒜氨酸的测定高效液相色谱法

1大蒜及其制品中蒜氨酸的测定高效液相色谱法本文件规定了大蒜及其制品（大蒜粉、大蒜片、大蒜片剂、大蒜软膏剂）中活性成分蒜氨酸（S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜）含量的高效液相色谱测定方法。本文件适用于大蒜及其制品（大蒜粉、大蒜片、大蒜片剂、大蒜软膏剂）中蒜氨酸的含量测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T2643大蒜及制品中蒜素的测定高效液相色谱法NY/T3871大蒜中蒜氨酸的测定高效液相色谱法NY/T4351大蒜及其制品中水溶性有机硫化合物的测定液相色谱-串联质谱法T/HAS105饲料原料大蒜粉DB65/T4511高蒜氨酸含量大蒜质量评价规范3术语和定义蒜氨酸AlliinS-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜（S-allyl-L-cysteinesulfoxide分子式为C6H11NO3S，CAS#：556-27-4，相对分子质量为177.22。4原理大蒜及其制品中蒜氨酸在紫外光区214nm波长处有最大吸收，经灭酶、水提取、液相色谱分离后，紫外检测器测定，外标法定量。5试剂或材料5.1试剂5.1.1甲醇（CH3OH）：分析纯（用于样品前处理）、色谱纯（用于HPLC分析）。5.1.2三氟乙酸（CF3COOH色谱纯。5.2溶液配制三氟乙酸溶液（0.06%，体积分数）：准确吸取0.60mL三氟乙酸（4.1.2）于预先加入一定量水的1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，经0.22μm滤膜过滤。5.3标准样品蒜氨酸标准样品（Alliin，C6H11NO3S，CAS：556-27-4）：含量≥99.0%。5.4标准溶液配制蒜氨酸标准储备液（200mg/L称取蒜氨酸标准物质0.020g（精确至0.00001g）置于100mL容量瓶中，用水溶解，稀释定容至刻度，摇匀，4℃保存，有效期1个月。临用前，精密量取贮备液1mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，色谱分析前用0.22μm微孔滤膜过滤。6仪器设备6.1高效液相色谱仪：配备紫外检测器。6.2分析天平：感量0.1mg、0.01mg。26.3匀浆仪。6.4高速粉碎机。6.5研钵。6.6超声波清洗仪。6.7离心机：转速8000r/min。6.8磁力搅拌恒温水浴锅：可控温控速。6.9实验室可调温电炉电子万用炉。6.10国家标准药检筛（150μm）。7样品及试样前处理7.1大蒜取有代表性的大蒜样品，平行做三份试验。称取试样50g（精确至0.1mg），置于500mL烧杯中，加水200mL，水煮灭酶10min，室温冷却，匀浆1min（20000r/min浆液定量转移置500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，离心（8000r/min）15min，精密移取上清液1mL，置50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。色谱分析前用0.22μm微孔滤膜过滤。7.2大蒜粉（片）大蒜粉：通过150μm试验筛，混匀。大蒜片：用粉碎机粉碎，通过150μm试验筛，混匀。称取蒜粉（片）0.3g（精确至0.1mg）置于50mL容量瓶中，加无水甲醇20mL，超声10min，加水20mL，超声10min，室温冷却，用水稀释定容至刻度，混匀，离心（8000r/min）10min，吸取上清液1mL，置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。色谱分析前用0.22μm微孔滤膜过滤。7.3大蒜片剂大蒜片剂：取大蒜片剂20片，用研钵研磨成粉末，混匀。称取大蒜片剂0.3g（精确至0.1mg）置于50mL容量瓶中，加无水甲醇20mL，超声10min，加水20mL，超声10min，室温冷却，用水稀释定容至刻度，混匀，离心（8000r/min）10min，吸取上清液1mL，置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。色谱分析前用0.22μm微孔滤膜过滤。7.4大蒜软膏剂称大蒜软膏剂1.0g（精确至0.1mg）置于50mL干燥的烧杯中，加预热的甲醇15mL，置磁力搅拌水浴锅（55℃)灭酶15min，加预热的水（55℃)20mL，提取5min，置50mL容量瓶中，加预热水淋洗容器，洗液合并置容量瓶中，室温冷却，加水稀释至刻度，摇匀，滤纸过滤。取续滤液2.0mL置10mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。色谱分析前用0.22μm微孔滤膜过滤。8测定方法8.1色谱条件耐水液相色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径3μm。流动相：三氟乙酸溶液（4.2）。流速：0.5mL/min。柱温：25℃。检测波长：214nm。8.2系统适用性试验8.2.1对分离度溶液进行色谱分析，蒜氨酸的分离度R≥1.5。8.2.2对标准溶液进行色谱分析，重复进样次数至少6次，检测所得结果的相对标准偏差≤2.0%。8.3系标准曲线的制作准确吸取一定量的蒜氨酸标准储备液（4.4用水配制成浓度约为2.27mg/L、4.54mg/L、9.09mg/L、22.73mg/L、45.46mg/L、90.92mg/L的系列标准溶液，供高效液相色谱仪测定。8.4测定3取待测液（6.1-6.4）和相应浓度的标准溶液（7.3）按照7.1色谱参考条件测定，做单点校准或多点校准，以保留时间定性，以色谱峰面积外标法定量。待测液和标准工作溶液中蒜氨酸的响应值应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱条件下，蒜氨酸标准溶液及空白溶液、待测液的色谱图见附录A。9试验数据处理大蒜及其制品中蒜氨酸含量的质量分数ω,按公式（1）计算：式中：ω——大蒜及其制品中蒜氨酸含量的质量分数的数值，单位为%；D——试样的稀释倍数；Ax——试样溶液中蒜氨酸峰面积值；CS——标准溶液的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；AS——标准溶液中蒜氨酸峰面积值；W——试样的取样量，单位为克（g测定结果用平行测定的算数平均值表示，计算结果保留3位有效数字。10精密度在重复性条件下获得的3次独立测定结果的相对标准偏差≤5.0%。11蒜氨酸HPLC参考色谱图大蒜及其制品中蒜氨酸的HPLC参考色谱图见附录A。（规范性）大蒜及其制品中蒜氨酸的HPLC参考色谱图 图A.1蒜氨酸标准物质HPLC色谱图 图A.2大蒜样品空白溶剂HPLC色谱图图A.3大蒜中蒜氨酸HPLC色谱图 图A.4大蒜粉（片）、大蒜片剂、大蒜软膏剂空白溶剂HPLC色谱图图A.5大蒜粉（片）中蒜氨酸HPLC色谱图 图A.6大蒜片剂中蒜氨酸HPLC色谱图图A.7大蒜软膏剂中蒜氨酸HPLC色谱图7参考文献[1]T/HAS105-2020饲料原