细胞破碎和分离技术

第四章细胞破碎和别离提

取技术发酵液或培养液预处理固液分离（离心或过滤）固体沉淀：胞内产物清液：胞外产物目标产物目标产物细胞破碎和细胞碎片分离本章内容一、细胞破碎的主要阻力：细胞壁细胞破碎的主要目的：破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内物质释放出来。各种微生物细胞壁组成与结构二、常用细胞破碎技术及原理〔一〕机械法〔二〕物理法〔三〕化学法〔四〕生物法〔五〕超临界细胞破碎技术〔一〕机械法利用高压、研磨或超声波等手段使细胞受到挤压，剪切和撞击作用1、珠磨法2、高压匀浆法3、超声破碎法1、珠磨法珠磨法原理：细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂〔直径小于1mm〕一起快速搅拌或研磨，研磨剂与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。注意：破碎时要采取冷却措施2、高压匀浆法利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲撞造成细胞破裂高压匀浆机进料口出料口注意：团状或丝状真菌不适用3、超声破碎法原理：空化作用和搅拌作用缺点：产生的热量不容易驱散，不适于大规模操作，主要用于实验室。。不同机械破碎方法的比较〔二〕物理法1、渗透压冲击法2、冷冻-融化法1、渗透压冲击法〔最温和〕将细胞放在高渗溶液中〔如高浓度蔗糖溶液〕，由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当到达平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。洋葱质壁分离仅适用于细胞壁较脆弱的细胞。2、冷冻-融化法〔2〕原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度增高引起细胞溶胀而破裂。〔1〕方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在室温中融化，反复屡次而到达破壁作用。适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复屡次，速率慢，产量低，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁〔三〕化学法〔化学渗透法〕1、碱处理2、酸处理3、化学试剂法1、碱处理pH值=碱处理可导致细胞溶解。优点：价格廉价，适于任何规模的操作，易使蛋白使活。2、酸热法盐酸对细胞壁中的某些成分〔主要是多糖和蛋白质〕的水解作用，使细胞壁结构变疏松，同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。3、化学试剂法〔1〕EDTA螯合法：导致外层膜不稳定或溶解革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。〔2〕有机溶剂法有机溶剂能溶解细胞壁的脂类，从而改变细胞通透性。能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。〔3〕外表活性物质化学法的优缺点优点①通用性差；②时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过80％。③有些化学试剂有毒，后续工作需设法别离除去。缺点细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液别离和进一步提取。〔四〕生物法1、酶溶法〔2〕常用的酶：溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶等。〔1〕原理：利用酶溶解细胞壁，使细胞壁受到局部或完全破坏；其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用较显著。溶菌酶：能直接水解G+菌细胞壁，作用位点是肽聚糖多肽链中的β-1，4糖甘键。G+菌的细胞壁G-菌的细胞壁2、自溶法通过调节温度、pH等诱导细胞产生溶解自身的酶。酵母自溶45-50℃12-24h〔五〕超临界细胞破碎技术1、超临界流体〔1〕临界温度：在温度高于某一数值时，任何大的压力均不能使该物质由气相转化为液相，此时的温度即被称之为临界温度；〔2〕临界压力：临界温度下，气体能被液化的最低压力称为临界压力。〔3〕超临界流体：指温度和压力处于临界条件之上的流体。CO2的临界值：31.26℃；7.38MPa2、超临界CO2的破壁原理超临界CO2密度近于液体，粘度近于气体，扩散系数为液体的100倍，因而具有惊人的溶解能力。超临界CO2易于渗透到细胞内，突然降压后，因细胞内外较大的压差而使细胞急剧膨胀而破裂。超临界细胞破碎技术适用于各类细胞的破碎1、细胞的处理量2、细胞壁的强度和结构3、目标产物对破碎条件的敏感性4、破碎程度三、选择破碎方法的依据适宜的操作条件应有高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取这三方面进行权衡1、简要说明常用的细胞破碎方法、原理及特点？作业与思考题细胞碎片去除和产品纯化同步的方法四、从发酵液直接别离产物细胞破碎目标产物细胞碎片很小，很难用过滤法除去。〔一〕双水相别离技术1、双水相体系简介明胶琼脂〔或可溶性淀粉〕1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现传统的双水相体系是指高聚物双水相体系憎水程度有所差异〔1〕聚乙二醇(PEG)/葡聚糖；〔2〕聚乙二醇(PEG)/盐相〔硫酸盐或者磷酸盐〕2、常用双水相体系聚乙二醇(PEG)无毒、无刺激性，具有良好的水溶性3、双水相体系别离细胞碎片目标产物细胞或细胞碎片优点：设备简单，容易放大缺点：规模放大时，本钱增加用PEG1500/NaH2PO4体系从Trichodermakoningii发酵液中别离纯化β-木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。〔二〕膨胀床别离技术1、膨胀床的定义〔1〕固定床：又称填充床，填充的固体物通常呈颗粒状，堆积成一定高度的床层。床层静止不动，流体通过床层进行别离纯化。〔2〕流化床：当流体通过床层的速度逐渐提高到某值时，填料颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床层体积出现膨胀，但是颗粒仍逗留在床层内而不被流体带出。床层的这种状态和液体相似称为流化床〔3〕膨胀床稳定的、返混很小的流化床，即所谓的膨胀床,它既能比较容易地让细胞或细胞碎片通过填料层，又能以填充床的模式来吸附目标产物。〔4〕膨胀床与固定床的区别膨胀床的床层上部安装有可调节床层高度的调节器，当料液从床底输入时，床层产生膨胀，高度调节器上升，床层空隙增加，允许菌体细胞或细胞碎片自由通过。因此，膨胀床吸附操作可直接处理菌体发酵液或细胞匀浆液，回收其中的目标产物。膨胀床吸附技术节省离心或过滤等处理过程〔5〕膨胀床与流化床的区别流化床的填料和液体在床层内混合程度高，吸附效率低，而膨胀床的填充颗粒根本悬浮于固定的位置，液体的流动与固定床相似，接近平推流，吸附效率高。2、膨胀床装置色谱柱调节柱床高度保证液体以平推流形式流过柱子3、膨胀床吸附剂〔1〕吸附剂应具备的条件①吸附性能好②沉降速率高③吸附剂要在粒径和密度上有差异④有良好孔道结构，不易被污染〔2〕常用吸附剂多糖包埋石英砂，玻璃微球等。如Streamline介质：在石英砂外外表包裹了一层琼脂糖物理吸附，化学吸附和离子交换吸附琼脂糖上的功能基团可以被修饰，提高目标产物的吸附容量4、膨胀床的操作〔5个步骤〕〔1〕平衡：用平衡缓冲液让膨胀床到达平衡，保持一定的膨胀率。膨胀2倍，吸附性能最好通过流速控制膨胀率〔2〕进料吸附把目标产物吸附在吸附剂上，让杂质或细胞碎片等固体颗粒流出膨胀床。〔3〕洗涤洗去留在柱内的细胞、细胞碎片和弱吸附性的杂质。洗涤结束后，改用固定床操作〔4〕洗脱采用固定床操作，将配制好的洗脱液用横流泵从柱上部导入，下部流出，分段收集，并分析检测目标产物的活性峰位置。〔5〕柱床的再生和清洗原因：非特异性吸附污染试剂：0.5-1mol/L的NaOH〔常用〕方法：控制流速，使柱床膨胀5倍，清洗3小时4、膨胀床的操作〔5个步骤〕〔1〕平衡〔2〕进料吸附〔3〕洗涤〔4〕洗脱〔5〕柱床再生和清洗5、膨胀床的应用纳豆激酶的别离提取纳豆：大豆经纳豆菌发酵而成降血压，抗癌抗氧化，溶血栓纳豆激酶1980年，日本心脑血管专家须见洋行博士，从事溶解血栓药物研究工作“下午两点半〞实验下午两点半：纳豆提取物参加到人工血栓中；下午五点半：血栓溶解2厘米1、泡豆蒸豆大豆，加水浸泡一夜后，蒸烂。

2、接种纳豆菌纳豆菌用热水溶解后，参加到大豆中，搅拌均匀，分装。

3、在恒温下发酵14-36小时

4、后熟〔活菌低温休眠〕发酵后，放在冰箱内低温熟成数小时，做好的纳豆无论是外观还是口感都会更好。纳豆的制作〔三〕泡载别离技术1、定义又称泡沫别离或泡沫吸附别离，是以气泡为介质，利用组分的外表活性差异进行别离的技术。空气2、原理通过向溶液鼓泡形成泡沫层，外表活性物质会聚集在泡沫层内，然后将泡沫层与液相主体别离。活性剂补充口泡沫液体破沫器泡沫液气体〔1〕外表活性物质的别离纯化（2）能与表面活性物质结合的任何物质如金属离子如蛋白质，废水中的去污剂等3、应用如：环境领域从工业污水如电镀废水、纺织废水中别离和