细菌的培养及鉴定思路课件

细菌培养及鉴定思路内江市第一人民医院叶帮芬标本采集原那么1.及时采集微生物标本作病原学检查2.在抗菌药物使用前采集标本3.采样时严格执行无菌操作4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂5.采样后立即送检6.送检标本应注明来源和检验目的咳痰方法病人先漱口，清洁口腔，去除外表的菌群病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液无痰可用3％～5％NaCl5ml雾吸约5min导痰以清晨第二口痰为佳标本采集后放置时间不超过2小时

清洁中段尿液尽量取早晨第一次尿液嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水女性病人收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人翻转包皮，清洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿

采集标本后立即送检！标本接收原那么严格实行核对制度：包括姓名、性别、年龄、门诊号/住院号、病床号、标本类型、容器、标识、检验目的等。所有拒收或退回标本均应在登记本上登记，登记内容包括：病人姓名、病区、床号送检医师、送检工程、拒收(退回)原因、拒收时间、经手人等痰标本涂片染色低倍镜下分类分级白细胞〔个〕上皮细胞〔个〕A>25<10B>25<25C<10>25A、B两种情况的痰适合做培养，C不合格，应重新留标本哥伦比亚血平板—营养要求高的细菌巧克力平板—含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用中国蓝/麦康凯平板—G-杆菌用SS平板—沙门氏菌和志贺氏菌用M-H平板—细菌药敏用TCBS平板—弧菌科细菌用沙包氏平板—真菌培养用真菌显色平板—真菌培养用罗氏培养基—分枝杆菌用常用的培养基种类和用途接种工具接种针和接种环：由三局部组成，即环〔针〕、金属柄和绝缘柄接种针：用于穿刺接种细菌接种环：用于固体、液体培养基的细菌接种器具：接种环〔上〕和接种针〔下〕柄约22cm2—5cm绝缘柄约7.5cm金属柄约14.5cm5—8cm安装环(针)的螺口(约8mm)操作原那么：无菌操作〔烧灼灭菌〕Asepticarea10-20cm外焰焰芯内焰细菌接种的根本程序灭菌接种环沾取标本接种灭菌接种环杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境细菌接种法平板划线接种法：

★目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。

★方法：★分区划线法：适用于含菌量较多的标本★连续划线法：适用于含菌量较少的标本液体培养基接种法穿刺接种法:用于观察细菌动力斜面接种法倾注培养法:用于细菌计数分区划线法(3区)第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环连续划线法细菌培养法细菌在固体培养基中的生长现象菌落★定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。★菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、外表、透明度、湿润度、黏度、溶血性★菌落类型：光滑型〔S〕、粗糙型〔R〕、黏液型〔M〕菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌落菌落与菌苔菌落的三个类型：

1.光滑型菌落〔SmoothtypeColony〕：又称S型2.粗糙型菌落〔RoughtypeColony〕：又称R型3.粘液型菌落〔MucoidtypeColony〕又称M型2024/1/2021S型菌落R型菌落M型菌落细菌在液体培养基中的生长现象混浊沉淀：多见于链状排列的细菌菌膜：多见于厌氧菌细菌在液体培养基中的生长现象：细菌在半固体培养基中的生长现象有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。细菌在半固体培养基中的生长现象有动力现象无动力现象斜面接种法接种斜面后菌落生长示意图〔菌苔〕革兰染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。革兰染色步骤

涂片包括涂片、枯燥、固定三步。涂片枯燥固定固定的目的：使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固；可改变菌体对染料的通透性；加热固定可杀死细菌，比较平安。

结晶紫1’碘液1’95%乙醇30〞复红1’

冲洗滤纸枯燥油镜观察冲洗冲洗冲洗革兰染色程序初染媒染脱色复染紫色〔G＋〕革兰氏染色步骤示意图革兰染色甲菌乙菌初染结晶紫媒染碘液脱色乙醇复染稀释复红紫色〔G＋〕红色〔G-〕革兰染色步骤示意图【结果】细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌；而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；阳性菌——紫色〔G+b)阴性菌——红色〔G-b)G+球菌显微镜下的杆菌G-杆菌Figure2-GramstainofGram-E.colicells革兰染色本卷须知标本涂片不宜太厚固定不宜过热脱色不宜过度选用培养18--24小时菌龄的细菌为宜抗酸染色原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,到达染色目的。抗酸染色步骤

1、涂片包括涂片、枯燥、固定三步。涂片枯燥固定抗酸染色步骤2、染色包括初染、脱色、复染三步。

石炭酸复红维持3-5’3%盐酸酒精30’’~1’美蓝复染1’

冲洗枯燥油镜观察冲洗冲洗初染脱色复染抗酸染色结果抗酸菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。抗酸染色本卷须知为防止交叉感染，标本先高压灭菌后再涂片染色染色充分脱色时间宁长勿短在涂抹痰标本时严禁对载玻片进行加热临床标本培养基选择血：血培养瓶中断尿：血平板、mac平板脑脊液：血培养瓶、血平板、巧克力平板穿刺液：血培养瓶、血平板、巧克力平板、mac平板胆汁：血平板、巧克力平板、mac平板大便:.麦康凯、SS、血平板临床标本培养基选择生殖道标本根据临床医生所写的检验工程接种相应的平板及操作：淋球菌培养接种淋球菌平板;念珠菌培养接种沙保罗培养基；支原体培养那么按?支原体培养的操作规程?操作；作普通培养那么接种血平板和巧克力平板

观察细菌在平板上的生长现象血平板：大小、形状、边缘、颜色、外表、透明度、湿润度、黏度、溶血性mac平板：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度巧克力平板：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度无菌部位标本2024/1/2048革兰阴性菌葡萄球菌痰培养真菌、链球菌菌落形态细菌的初步分类细菌的别离与纯化：自血平板挑出待检菌株的单菌落进行初步的鉴定。如果混有杂菌，应该重新转种分纯。染色与镜检：首先通过革兰氏染色确定根本的分类：〔1〕G+球菌〔2〕G-球菌〔3〕G-杆菌〔4〕G+杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可能是真菌。细菌的初步分类触酶试验主要用于G+球菌的分类。葡萄球菌属〔微球菌属〕：触酶〔+〕，链球菌属及肠球菌：触酶〔-〕氧化发酵试验〔O/F试验〕根据细菌在无氧环境中能否利用碳源将细菌分为非发酵菌(O/F阴性)和发酵菌〔O/F阳性〕氧化酶试验：肠杆菌的氧化酶〔-〕，非发酵菌多数氧化酶〔+〕，但嗜麦芽窄食单胞菌和不动杆菌的氧化酶〔-〕，弧菌科氧化酶〔+〕G-杆菌的鉴定途径G染色G-b

O/F试验和氧化酶〔ox)试验OF〔-〕OF〔+〕OF〔+〕ox〔+〕ox〔-〕ox〔+〕非发酵型细菌肠杆菌科弧菌科G-杆菌ATB细菌鉴定系统肠杆菌科、弧菌科ID32E肠杆菌科鉴定条ATBG-5肠杆菌科药敏试条非发酵菌ID32GN非发酵菌鉴定条ATBPSE5非发酵菌药敏试条

2024/1/2054革兰阴性鉴定及药敏试条血清学试验肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认：

1.志贺氏菌多价和单价凝集血清

2.沙门氏菌多价和单价凝集血清

3.致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清

4.

耶尔森氏菌凝集血清G+球菌的鉴定途径1.首先根据菌落特点和革兰氏染色判断是否为G+球菌。2.根据触酶结果判断为葡萄球菌〔微球菌属〕or链球菌〔肠球菌〕3.葡萄球菌属：触酶〔+〕链球菌属及肠球菌：触酶〔-〕G+球菌的鉴定途径葡萄球菌属：触酶〔+〕、氧化酶〔-〕、O-F试验：发酵型微球菌属：触酶〔+〕、氧化酶〔+〕、O-F试验：氧化型金黄色葡萄球菌最重要的致病葡萄球菌血平板上菌落有明显β溶血环，颜色呈金黄色、灰白色或柠檬色分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇血浆凝固酶和DNA酶阳性

2024/1/2060葡萄球菌ATB细菌鉴定系统葡萄球菌：ID32STAPH葡萄球菌鉴定条ATBSTAPH5葡萄球菌药敏试条2024/1/2062葡萄球菌鉴定、药敏试条链球菌鉴定途径链球菌属:触酶〔-〕、七叶苷〔-〕、6.5%NaCl〔-〕

肠球菌：触酶〔-〕、七叶苷〔+〕、6.5%NaCl〔+〕链球菌鉴定途径根据G染色和触酶结果确定为链球菌，然后再根据细菌的溶血情况和菌落特点判断鉴定途径链球菌鉴定途径根据G染色和触酶结果确定为链球菌，然后再根据细菌的溶血情况和菌落特点判断鉴定途径链球菌鉴定途径

α溶血

Optochin

R

S

+胆汁七叶苷--肺炎链球菌

D群链球菌草绿色链球菌

链球菌鉴定途径

β溶血

杆菌肽CAMP胆汁七叶苷

S

+

+

A群链球菌B群链球菌D群链球菌6.5%NaCl--+

非肠球菌肠球菌链球菌鉴定途径

γ溶血

胆汁七叶苷+--D群链球菌草绿色链球菌-6.5%NaCl+非肠球菌肠球菌

ATB细菌鉴定系统链球菌：RapidID32STREP链球菌鉴定条ATBSTREP5链球菌药敏试条

肠球菌：RapidID32STREP链球菌鉴定条ATBEnteroc5肠球菌药敏试条G-杆菌的鉴定途径G染色G-b

O/F试验和氧化酶〔ox)试验OF〔-〕OF〔+〕OF〔+〕ox〔+〕ox〔-〕ox〔+〕非发酵型细菌肠杆菌科弧菌科ATB细菌鉴定系统肠杆菌科、弧菌科ID32E肠杆菌科鉴定条ATBG-5肠杆菌科药敏试条非发酵菌ID32GN非发酵菌鉴定条ATBPSE5非发酵菌药敏试条

真菌的鉴定途径沙包氏培养基选择性培养科玛嘉念珠菌显色培养基革兰氏染色：阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体通过血清芽管形成试验鉴定出白念珠菌CSF标本通过墨汁染色可以初步判断为新型隐球菌ATB细菌鉴定系统酵母样真菌：ID32C酵母菌鉴定条ATBFUNGUS3酵母菌药敏条嗜血杆菌的鉴定途径只能在营养条件高的巧克力平板上生长，菌落为中等大小、圆形、灰白色、透明革兰染色：G-小杆菌卫星实验就可以帮助初步鉴定2024/1/2079嗜血杆菌ATB细菌鉴定系统嗜血杆菌：

APINH嗜血杆菌鉴定条

ATBHAEMO嗜血杆菌药敏试条奈瑟氏菌属鉴定在血平板和巧克力平板上生长，mac上不生长血平板形成灰色、湿润、透明或半透明、不溶血的菌落巧克力平板上形成圆形、灰蓝色的似露滴状菌落革兰染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆形，凹面相对氧化酶和触酶都均为阳性

奈瑟氏菌属有11个种，临床就淋病奈

菌和脑膜炎奈瑟菌最为重要奈瑟氏菌属鉴定流程

菌落观察：灰色、湿润、透明或半透明、不溶血

涂片染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆状

氧化酶试验+触酶+

+麦芽糖--

脑膜炎奈瑟菌

淋病奈瑟菌莫拉菌有4个种，仅卡他莫拉菌对人类有致病性莫拉菌属卡他莫拉菌鉴定在血平板和巧克力平板上生长，mac上不生长血平板形成灰白色或红棕色、不溶血的菌落，培养48小时，菌落外表枯燥，接种环可推移整个菌落且不粘环革兰染色：G-双球菌，呈咖啡豆形氧化酶和触酶都为阳性卡他莫拉菌鉴定流程菌落观察：灰白色或红棕色、光滑、不溶血、枯燥涂片染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆状氧化酶试验+触酶++DNAM酶--

卡他莫拉菌其他奈瑟氏菌

奈瑟氏菌属与相似菌鉴别的关键性试验葡萄糖麦芽糖蔗糖硝酸盐复原DNA酶淋病奈瑟菌+--------脑膜炎奈瑟菌++------卡他莫拉菌------++ATB细菌鉴定系统奈瑟氏菌属和莫