生殖毒性研究现状及进展

药物生殖毒性研究现状及进展上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）孙祖越上海市计划生育科学研究所中国生育调节药物毒理检测中心世界卫生组织人类生殖研究合作中心二一四年七月十一日·

上海培训提纲第一部分：新药生殖毒性研究的概念（何意？）第二部分：新药生殖毒性研究的起因（何故？）第三部分：新药生殖毒性研究的内容（何为？）第四部分：新药生殖毒性研究的进展（何往？）上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）内涵：是一门研究药物对雌雄生命生殖系统及其功能活动毒副现象及其作用机制的科学。它包括对动物的精卵形成、交配、排卵、射精、合子形成、着床、妊娠、分娩和哺乳过程；从生殖细胞分化到整个细胞发育，从胚胎细胞发育到个体器官形成，从亲体繁殖能力到后代生殖功能，其间涉及到的亲子代生殖系统器官结构、生理和生化功能、遗传和生殖特征，诸如此类方面的毒理学研究。是毒理学的重要分支。外延：药物生殖毒性研究主要包括生育力与早期胚胎发育毒性试验（也称一般生殖毒性试验，Ⅰ段生殖毒性试验）、胚胎－胎仔发育毒性试验（也称致畸敏感期毒性试验，Ⅱ段生殖毒性试验）和围产期毒性试验（Ⅲ段生殖毒性试验）等。目的：药物生殖毒性研究的目的是通过动物试验反映供试品对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩和哺乳等亲代生殖机能不良影响，以及对子代胚胎—胎儿发育、出生后发育的不良影响。上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）第一部分：新药生殖毒性研究的含义第二部分：新药生殖毒性研究的起因反应停事件：1956年，德国格伦南苏药厂生产销售Thalidomide（又称反应停、沙利度胺、肽咪哌啶酮），曾经有100万人服用，至1963年全世界共发现海豹肢畸形儿1.2万多人。海豹肢畸形：上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）经典方法一、生育力与早期胚胎发育毒性试验（Ⅰ段生殖毒性试验，也称一般生殖毒性试验）二、胚胎－胎仔发育毒性试验（Ⅱ段生殖毒性试验，也称致畸敏感期毒性试验）三、围产期毒性试验（Ⅲ段生殖毒性试验）上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）第三部分：新药生殖毒性研究的内容大

鼠

胚

胎

发

育

时

期

简

表为何设计三段生殖毒性研究？上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）妊娠天次典型事件出现系统形成系统妊娠天次典型事件出现系统形成系统11个细胞出现11前肢芽出现,后神经孔关闭22个细胞出现12尾芽出现34-8个细胞出现13后足板形成,松果体凹出现神经系统4桑椹胚出现14/5孵出囊胚15口盖板闭锁，体表出现毛囊6内胚层出现16冠状血管明显腭突融合心血管系统消化系统7卵圆柱和外胚层出现17REICHERT膜破裂8早期原条和神经板出现神经系统19肺泡管形成呼吸系统9尿囊、前肠、卵黄囊脏层岛出现心血管系统消化系统20/10尿囊与绒毛膜接触原生殖细胞泌尿系统生殖系统21出生第-9周第-8周第-7周第-6周第-5周第-4周第-3周第-2周第-1周雄鼠解剖第-2周第-1周第1周第2周第3周第4周第5周第6周第1周第2周第3周第4周第5周第6周第7周第8周F0代雄鼠F1代仔鼠F0代雌鼠：分娩点：交配点：离乳点：性成熟图例：Ⅰ段Ⅱ段Ⅲ段上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）两代孙祖越，周莉，闫晗，何桂林.如何成功地开展药物临床前生殖毒性试验.中国新药杂志.2011，20（22）：1651-1660.如何设计三段生殖毒性研究？三、经典方法–1：生育力与早期胚胎发育毒性试验（Ⅰ段）上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）

《药物生殖毒性研究技术指导原则》课题研究组.药物生殖毒性研究技术指导原则.2006，11.

1、目的：观察供试品是否对动物的生育力和早期胚胎发育存在影响。2、试验方法和观察指标：（1）试验方法：雄鼠交配前连续给药9周，雌鼠交配前连续给药2周，按1:1合笼每天上午作阴道涂片检查，查到精子或阴栓日定为妊娠GD0，雌鼠继续给药至GD7，雄鼠交配成功后停药处死，二周内未交配上雌、雄大鼠停药处死，对雄鼠生殖系统的器官和精子质量进行检查。交配成功的妊娠大鼠于GD14处死，解剖检查。（2）观察指标：①一般状况：外观体征、死亡、体重、摄食量、阴道涂片、交配行为；②雌性大鼠指标：黄体、受孕率、妊娠率、着床数、生殖器官系数、相关器官组织病理学检查、相关激素水平；③雄性大鼠指标：生殖器官脏器系数脏器系数、组织病理学检查；精子活率、精子数量和精子形态观察分析；交配成功率、生育率和交配行为，相关激素水平；④胎仔指标：活胎、死胎和吸收胎数量，胎仔外观及活胎连子宫的重量。上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）三、经典方法–2：胚胎－胎仔发育毒性试验（Ⅱ段）

《药物生殖毒性研究技术指导原则》课题研究组.药物生殖毒性研究技术指导原则.2006，11.

1、目的：观察供试品对妊娠大鼠、胚胎及胎仔发育的影响。2、试验方法和观察指标：（1）试验方法：雄鼠、雌鼠合笼交配，次日上午阴道涂片检查，查到精子定为妊娠GD0，妊娠GD6开始给药至妊娠GD15，妊娠GD20处死母鼠，解剖，取出胎仔，检查黄体数、胎重（连子宫）、胎盘重量、活胎数、死胎数（含吸收胎）、胎仔性别、重量、顶臀长及外观。取1/2胎仔用茜素骨骼染色液染色作骨骼畸形检查；另取1/2胎仔用Bouin氏液固定作内脏检查。

（2）观察指标：①一般状况：妊娠第0、3、6、10、13、15和20天孕鼠体重；GD0、GD7、GD14和GD20的摄食量；GD20处死母鼠，取出胎仔，检查黄体数、胎重（连子宫）、胎仔总重、胎盘重量、胎盘外观、活胎数、死胎数（含吸收、胎仔性别、重量、顶臀长及外观、内脏、骨骼，并计算着床数；激素水平。②胎仔畸形检查：

A头部畸形检查：有无脑积水、露脑、脑疝、脑膜膨出、无眼、小眼、无耳、腭裂；

B四肢畸形检查：有无多趾、并趾、少趾、无趾、足内翻、短趾；

C躯干畸形检查：有无脐疝、腹裂、脊髓膨出、脊柱裂、脊柱侧突；

D尾巴畸形检查：有无短尾、卷尾、无尾、尾分叉；

E肛门畸形检查：有无肛门闭锁；

F骨骼畸形检查：头颅是否完整，骨化程度；有无胸骨节缺失、骨化不全、双骨化点、胸骨节错位、多肋、少肋、肋骨分叉、肋融合、波状肋；有无四肢骨骨化不全、粗短、畸形、多趾、少趾等；

G器官畸形检查：有无腭裂、舌异常、鼻道扩大、单鼻道、脑水肿、肾积水；眼球是否正常；心、肝、脾、肺、肾、子宫等脏器大小和位置是否异常。上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）三、经典方法–3：围产期毒性试验（Ⅲ段）

《药物生殖毒性研究技术指导原则》课题研究组.药物生殖毒性研究技术指导原则.2006，11.

1、目的：观察供试品对妊娠、哺乳雌鼠以及胚胎和子代发育是否有影响。2、试验方法和观察指标：（1）试验方法：雌鼠、雄鼠按2:1合笼交配，于当日下午5时后合笼，次日上午作阴道涂片检查，查到精子或阴栓确定为妊娠GD0。雌鼠从妊娠GD15起，开始给药至仔鼠断乳（出生后第21天），停药后颈椎脱臼法处死母鼠，解剖，肉眼观察，如有异常作病理学检查。仔鼠出生4天后，每窝留仔鼠8只（雌、雄各4只），若雌雄比例不均，总数仍保持8只，以维持哺乳的平衡，若每窝仔鼠数不足8只，则不剔除仔鼠。畸形检查；另取1/2胎仔用Bouin氏液固定作内脏检查。

（2）观察指标：①母鼠：母鼠的体重、摄食量、分娩时间、产仔数、死亡率和激素水平等。②仔鼠：

A外观畸形（数）率、幼仔出生时的存活（数）率、哺育期间的成活（数）率、性别比例和生长指数；

B仔鼠生理发育和断乳前神经发育测试：生理发育记录耳廓分离、出毛、门齿萌出、张耳、睁眼、龟头包皮腺裂开和阴道张开的时间；反射发育指标记录出现平面翻正（从出生后第2天开始检测）、悬崖回避（出生后第3天开始检测）、瞳孔反射（从睁眼后开始检测）和听觉惊愕反射（从出生后第7天开始检测）达标时间；

C仔鼠自主及行为活动功能测试：测定出生后第10天仔鼠5分钟内的自发活动次数，出生后第20天仔鼠的游泳行为和游泳时间；

D仔鼠的生殖功能测试：F1代小鼠的交配率和受孕率。技术：发情周期中大鼠阴道涂片结果1、SD大鼠发情前期（巴氏X66）

2、SD大鼠发情期（巴氏X66）

3、SD大鼠发情后期（巴氏X66）

4、SD大鼠发情间期（巴氏X66）

上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）一、新物生殖毒性研究内容更加深入细致二、药物生殖毒理评价技术更加严谨规范上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）第四部分：新药生殖毒性研究的进展（一）生殖器官概念扩大化（二）研究技术水平纵深化（三）生殖毒性概念健康化（四）生殖毒性研究功能化（五）生殖毒性研究人群化上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）一、新药生殖毒性研究更加深入细致传统男性生殖器官现代男性生殖器官

睾丸附睾输精管射精管阴茎等

睾丸附睾输精管射精管阴茎前列腺包皮腺精液囊提肛肌肛门括约肌

等上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）（一）生殖器官概念扩大化参考：

上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）举例：男性生殖器官解剖图上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）举例：ED010523灌胃20天后对去势大鼠性器官

重量、脏器指数的影响（Mean

SD，N=10）

正常对照去势模型组丙酸睾酮昔多酚ED1浸膏ED010523(mg/kg)

1.25(mg/kg)90(mg/kg)450(mg/kg)50100200体重（g）254.00±25.45270.00±9.09249.00±25.20255.00±32.73269.00±13.00260.50±11.27229.50±16.91236.50±14.80包皮腺（g）0.08±0.01*

0.06±0.020.10±0.02*

0.07±0.010.08±0.01*

0.07±0.010.07±0.010.08±0.01*

（脏器系数）0.03±0.000.01±0.000.02±0.010.03±0.010.03±0.000.03±0.000.03±0.000.03±0.01精液囊（g）0.59±0.17*

0.28±0.052.27±0.45*

0.22±0.040.51±0.23*

0.39±0.07*

0.52±0.17*

0.43±0.16*

（脏器系数）0.24±0.070.10±0.020.91±0.190.09±0.020.19±0.090.15±0.030.23±0.080.19±0.07前列腺（g）0.67±0.17*

0.21±0.040.69±0.13*

0.20±0.040.44±0.19*

0.38±0.10*

0.48±0.10*

0.58±0.18*

（脏器系数）0.28±0.080.08±0.020.28±0.070.08±0.030.16±0.070.15±0.040.21±0.030.25±0.08提肛肌（g）0.29±0.05*

0.16±0.040.25±0.08*

0.17±0.040.28±0.11*

0.27±0.11*

0.29±0.08*

0.25±0.11*

（脏器系数）0.12±0.050.06±0.010.10±0.030.07±0.020.10±0.040.11±0.040.13±0.040.11±0.05上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）（二）研究技术水平纵深化

传统研究水平

现代研究水平一般生殖毒理学致畸敏感期毒性试验围产期毒性试验组织病理学毒性研究细胞生物学毒性研究等一般生殖毒理学致畸敏感期毒性试验围产期毒性试验组织病理学毒性研究细胞生物学毒性研究

分子毒理学研究基因毒理学研究

等M

：DNAMarkC：对照E1：100nM爱普列特E2：300nM爱普列特E3：1000nM爱普列特ME3E2E1C上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）举例：爱普列特治疗前列腺增生研究药物影响Bcl-2

基因电泳特征举例：爱普列特作用于输精管上皮细胞的研究

爱普列特对Bcl-2基因序列的影响上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）*注：Exp.1:标本(PRO4);Exp.2:标本(LN3)

转移灶癌(LN3)与原发灶(PRO4)前列腺癌细胞的基因表达水平比较

上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）举例：前列腺癌细胞转移后基因毒理学研究

基因芯片技术测定转移后基因表达上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）（三）生殖毒性概念健康化传统毒性概念现代健康概念高剂量毒性反应化合物毒性效应等

高剂量毒性反应化合物毒性效应化合物副反应开发（昔多酚壮阳效应）（舍曲林抗早泄作用）等举例：舍曲林治疗男性早泄药效学研究

药物对大鼠性功能的影响（

X

SD）

分组剂量(mg/kg)动物数（N）追逐次数（N）扑捉爬跨次数（N）射精潜伏期（S）潜伏期（min）次数（N）舍曲林384.75±2.2510.69±3.792.88±0.992.00±1.313.67±1.851094.22±1.7212.63±3.81*3.78±1.561.44±0.885.31±1.43*3075.43±1.9015.26±6.41*3.00±1.151.29±0.764.70±0.91*正常对照74.29±1.986.36±2.771.57±0.790.57±0.792.73±0.92*P<0.05vs

正常对照组上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）（四）生殖毒性研究功能化常规研究内容扩大研究内容注重器质性毒性反应等

注重器质性毒性反应注意到功能性毒性反应等上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）常规研究内容扩大研究内容脏器重量及其系数测定（前列腺、精囊腺、包皮腺和提肛肌）组织病理学分析（前列腺、精囊腺、包皮腺和提肛肌）等

功能性深入研究

（阴茎勃起试验）腺体分泌功能检测

（体内睾丸酮及双氢睾丸酮水平测定）机制探讨

（动物海绵体组织中cGMP水平测定）等举例：中药ED010523治疗阳痿药效学研究上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）（五）生殖毒性研究人群化传统研究对象扩大研究内容动物或人个体研究等

人群的流行病研究等等举例：人群精子质量调查研究

参考：李刚等.成都地区549例大学生精子质量调查.中华男科学2003，9(9)：673-678.上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）（一）涉及的内容面广量大（二）文辞的表述严谨贴切（三）指标的选择具体详实（四）技术的操作规范严格（五）研究的程度高深玄妙上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）二、新药生殖毒性评价技术更加严谨规范举例：新旧指南上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）（一）涉及的内容面广量大原有内容现有内容动物选择剂量设计给药时间给药途径观察和报告等

动物选择剂量设计给药时间给药途径观察和报告组织胚胎学内容妊娠或哺乳动物的药代动力学特定受试物的F2代生殖毒性等举例：原有表述上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）举例：现有表述（1）上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）举例：现有表述（